郭燁 馬慶云 趙文麗 段風(fēng)

1. 100190，北京市中關(guān)村醫(yī)院口腔科； 2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科；3. 西安醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院口腔科

生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5(growth arrest-special transcript 5，GAS5)是一個與牙周病有關(guān)的lncRNA，被報道在牙周炎患者中表達降低[1]。GAS5在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中GAS5表達上調(diào)且發(fā)揮著促進成骨分化的作用[2]，然而其是否參與人牙周膜干細胞(hPDLSCs)成骨分化并不清楚。本研究旨在觀察GAS5在hPDLSCs成骨誘導(dǎo)前后的表達變化，并分析靶向干擾其表達對hPDLSCs成骨分化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 基本材料

hPDLSCs(上海聯(lián)邁); DMEM完全培養(yǎng)基(深圳百恩維); GAS5-siRNA及陰性對照NC-siRNA(上海吉瑪); miR-222-3p模擬物、miR-222-3p抑制劑antimiR-222-3p(百奧邁科生物); 脂質(zhì)體3000、Trizol試劑、茜素紅和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京索萊寶)； psiCHENK2載體質(zhì)粒(上?？吕?；倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本); CO2培養(yǎng)箱(上海博迅)； RT-PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

采用DMEM完全培養(yǎng)基在濕度飽和、37 ℃和5% CO2常規(guī)條件的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)hPDLSCs；待貼壁生長至90%密度時，加入0.25%胰蛋白酶消化，并按照1 ∶4比例傳代。將第3代hPDLSCs接種至6孔板上，培養(yǎng)至80%匯合度時，將細胞分為對照組和誘導(dǎo)組，對照組細胞不做處理，而誘導(dǎo)組細胞以含10 nmol/L地塞米松、0.05 mmol/L維生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。3 d換液/次，待培養(yǎng)14 d后采用RT-PCR檢測GAS5、Runx2、ALP和OCN表達。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

實驗分為： (1)未轉(zhuǎn)染組：正常培養(yǎng)； (2)NC-siRNA組：轉(zhuǎn)染NC-siRNA； (3)GAS5-siRNA組：轉(zhuǎn)染GAS5-siRNA； (4)GAS5-siRNA+antimiR-NC組：共轉(zhuǎn)染GAS5-siRNA和antimiR-NC；GAS5-siRNA+antimiR-222-3p組：共轉(zhuǎn)染GAS5-siRNA和antimiR-222-3p，其中，每組設(shè)3 個復(fù)孔。將hPDLSCs接種至6 孔板，培養(yǎng)至70%匯合度時，按照脂質(zhì)體3000說明書對hPDLSCs進行瞬時轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染6 h后換液，培養(yǎng)48 h收集各組細胞，RT-PCR檢測GAS5和miR-223-3p表達水平評價轉(zhuǎn)染效率后，再以成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。

1.4 茜素紅染色

待1.2和1.3中各組細胞成骨誘導(dǎo)14 d后，磷酸緩沖液將各組細胞洗滌2 遍。4%多聚甲醛固定25 min后，茜素紅染色15 min；洗去染液后，顯微鏡觀察拍照。

1.5 RT-PCR檢測

按照Trizol試劑說明書提取hPDLSCs總RNA后，紫外分光度計檢測RNA濃度；將RNA行逆轉(zhuǎn)錄后，根據(jù)2×SYBR Green PCR Mastermix說明書上RT-PCR儀進行擴增，U6和β-actin作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算GAS5、miR-222-3p、Runx2、ALP和OCN mRNA表達。

1.6 雙熒光素酶報告

基因?qū)嶒灢捎肧tarbase2.0軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)GAS5和miR-222-3p之間存在互補的結(jié)合位點。將野生和突變后的GAS5 3' UTR區(qū)克隆重組至psiCHENK2載體上，作為GAS5野生型(GAS5-WT)和突變型(GAS5-MUT)載體質(zhì)粒；參照脂質(zhì)體3000說明書將miR-223-3p模擬物、miR-NC分別與GAS5-WT、GAS5-MUT共轉(zhuǎn)染至hPDLSCs中，分別標記為miR-223-3p+GAS5-WT、miR-NC+GAS5-WT、miR-223-3p+GAS5-MUT、miR-NC+GAS5-MUT，每組設(shè)3 個復(fù)孔；轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)試劑盒說明書檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 成骨分化后GAS5表達上調(diào)

與對照組比較，誘導(dǎo)組hPDLSCs成骨誘導(dǎo)14 d后有鈣化結(jié)節(jié)形成(圖1)，Runx2(2.49±0.15vs1.00±0.00)、ALP(1.65±0.11vs1.00±0.00)和OCN(2.05±0.13vs1.00±0.00) mRNA表達升高且伴隨著GAS5(3.56±0.18

圖1 成骨誘導(dǎo)后PDSCs茜素紅染色結(jié)果 (×200)vs 1.00±0.00)表達上調(diào)(P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)染后hPDLSCs中GAS5表達下調(diào)

與未轉(zhuǎn)染組比較，NC-siRNA組中GAS5表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.94±0.09vs1.00±0.00，P>0.05)；然而，GAS5-siRNA組中GAS5表達(0.19±0.04)較NC-siRNA組降低(P<0.05)。

2.3 GAS5低表達抑制hPDLSCs成骨分化

NC-siRNA組與未轉(zhuǎn)染組中鈣化結(jié)節(jié)程度無差異，而GAS5-siRNA組中鈣化結(jié)節(jié)程度較NC-siRNA組減輕(圖2)；與未轉(zhuǎn)染組比較，NC-siRNA組中Runx2(0.97±0.06vs1.00±0.00)、ALP(1.01±0.09vs1.00±0.00)、OCN(0.95±0.08vs1.00±0.00) mRNA表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與NC-siRNA組比較，GAS5-siRNA組中Runx2(0.48±0.04)、ALP(0.66±0.04)、OCN(0.52±0.03) mRNA表達降低(P<0.05)。

2.4 GAS5與miR-222-3p模擬共轉(zhuǎn)染

GAS5與miR-222-3p之間存在互補的結(jié)合位點[3-4]； miR-222-3p模擬物和GAS5-WT共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性較miR-NC降低(0.29±0.03vs1.00±0.00，P<0.05)，但miR-222-3p模擬物和GAS5-MUT共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性和miR-NC相比(0.95±0.08vs1.00±0.00)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 GAS5低表達上調(diào)hPDLSCs中miR-222-3p表達

NC-siRNA組和未轉(zhuǎn)染組中miR-223-p表達(1.02±0.09、1.00±0.00)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；GAS5-siRNA組中miR-223-p表達(2.73±0.13)較NC-siRNA組升高(P<0.05)。

圖2 GAS5-siRNA處理后hPDLSCs茜素紅染色結(jié)果(×200)

2.6 下調(diào)miR-222-3p逆轉(zhuǎn)對GAS5低表達對hPDLSCs成骨分化的作用

與NC-siRNA組比較，GAS5-siRNA組中鈣化結(jié)節(jié)程度減輕，而miR-222-3p(2.89±0.15vs1.00±0.00)表達升高，而Runx2(0.45±0.03vs1.00±0.00)、ALP(0.59±0.03vs1.00±0.00)和OCN (0.50±0.04vs1.00±0.00)mRNA表達降低(P<0.05)；與GAS5-siRNA組比較，GAS5-siRNA+antimiR-NC組之間鈣化結(jié)節(jié)程度和miR-222-3p(2.95±0.19)以及Runx2(0.43±0.03)、ALP(0.61±0.04)和OCN (0.52±0.04)mRNA無明顯差異(P>0.05)；與GAS5-siRNA+antimiR-NC組比較，GAS5-siRNA+antimiR-222-3p組中鈣化結(jié)節(jié)程度加重(圖3)，miR-222-3p表達(1.17±0.09)降低，而Runx2(0.64±0.04)、ALP(0.82±0.06)和OCN(0.77±0.05)mRNA表達升高(P<0.05)(圖3)。

3 討 論

GAS5是一種腫瘤抑制和生長停滯相關(guān)的lncRNA，與多種干細胞自我更新和分化有關(guān)。GAS5可通過維持NODAL信號來促進人胚胎干細胞自我更新[5]，通過調(diào)控miR-18a/CTGF軸負向調(diào)控間充質(zhì)干細胞的成脂分化[6]； 通過調(diào)節(jié)miR-135a-5p/FOXO1促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[2]。然而，GAS5是否參與hPDLSCs成骨分化并不清楚。

ALP、Runx2和OCN是成骨分化的重要指標，其表達水平的高低可反映成骨分化能力的強弱[7]。本研究對hPDLSCs成骨誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，hPDLSCs有鈣化結(jié)節(jié)形成，同時ALP、Runx2和OCN mRNA以及GAS5表達升高。結(jié)果表明，hPDLSCs成骨分化后GAS5表達上調(diào)。這提示，GAS5可能在hPDLSCs成骨分化過程中發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)染GAS5-siRNA成功下調(diào)GAS5發(fā)現(xiàn)，hPDLSCs礦化結(jié)節(jié)能力減弱且ALP、Runx2、OCN mRNA表達降低。表明，下調(diào)GAS5表達可抑制hPDLSCs成骨分化。提示，在hPDLSCs成骨分化過程中GAS5發(fā)揮著積極作用。

圖3 GAS5-siRNA+antimiR-222-3p處理后hPDLSCs茜素紅染色結(jié)果(×200)

lncRNA可通過競爭性結(jié)合miRNA靶基因mRNA的3'-非編碼區(qū)域間接抑制miRNA對mRNA的調(diào)控作用，還可作為競爭性內(nèi)源RNA發(fā)揮海綿吸附作用抑制miRNA的表達[8]。本研究采用Starbase2.0軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)GAS5和miR-222-3p之間存在互補的結(jié)合位點。miR-222-3p低表達可通過IGF-1/ERK途徑和Smad5-Runx2信號軸促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化[9-10]。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實GAS5可與miR-222-3p靶向結(jié)合；另外，在GAS5低表達的hPDLSCs中發(fā)現(xiàn)miR-222-3p表達升高。進一步下調(diào)miR-222-3p表達后發(fā)現(xiàn)，GAS5低表達對hPDLSCs成骨分化的抑制作用減弱。這表明，GAS5可通過靶向miR-222-3p調(diào)控hPDLSCs成骨分化。

綜上，hPDLSCs成骨分化后GAS5表達上調(diào)，下調(diào)GAS5表達可通過靶向調(diào)控miR-222-3p抑制hPDLSCs成骨分化。