王妍 李立華 徐宗藝 王艷敏 李靜 白卉

(中國林學(xué)會(huì)，北京，100091) (黑龍江省林學(xué)會(huì)) (黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所(黑龍江省速生林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室))

楊樹(Populusspp.)在分類學(xué)中的定位為楊柳科(Salicaceae)楊屬(PopulusL.)，廣泛的分布于華中、華北、東北、西北等遼闊的地區(qū)，我國楊樹品種種類豐富，其中包含很多變種、雜交種、從境外引種的品系[1-3]。楊樹木材，既在農(nóng)業(yè)和林業(yè)產(chǎn)業(yè)中創(chuàng)造了可觀的經(jīng)濟(jì)收益[4]，也在工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的用途。為滿足人類生產(chǎn)生活日益增長(zhǎng)的需求，楊樹新品種、良種、雜交品系不斷推向市場(chǎng)，與此同時(shí)，識(shí)種辨種的困難也隨之而來。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征描述，非專業(yè)人員無法精準(zhǔn)而迅速的區(qū)分，導(dǎo)致苗木交易市場(chǎng)魚目混珠，品種保護(hù)難以推行[5-6]，品種權(quán)人的權(quán)益難以保障。因此，研建切實(shí)有效的品種鑒別方法，并對(duì)各類品種進(jìn)行有效區(qū)分十分必要[7-10]。SSR(simple sequence repeat，SSR)分子標(biāo)記，具有多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)便、共顯性、多等位基因變異等優(yōu)點(diǎn)，在探究遺傳資源的多樣性[11-12]、聚類分析、系統(tǒng)發(fā)育[13]等問題時(shí)具有明顯優(yōu)勢(shì)[14]，因此，SSR分子標(biāo)記技術(shù)現(xiàn)已在品種鑒別[15]、良種保護(hù)等許多方面得到廣泛的應(yīng)用。

本研究以東北地區(qū)楊樹新品種、良種、廣泛栽培的已知品種為研究對(duì)象，對(duì)各無性系進(jìn)行SSR分析，從分子水平對(duì)40個(gè)無性系進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建與遺傳關(guān)系分析；利用各無性系的指紋圖譜，制成包含DNA遺傳背景、引物信息、產(chǎn)物片段長(zhǎng)度等信息豐富且易于獲取的二維碼。本研究補(bǔ)充了全國楊屬分子基因庫，構(gòu)建了楊屬品種二維碼，建立了便捷的楊屬品種鑒別方法，研究結(jié)果可為東北地區(qū)楊樹品種保護(hù)、品種鑒定等提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)楊屬品種

本研究選擇東北地區(qū)的40個(gè)楊屬品種為試驗(yàn)材料，各品種由牡丹江陽明區(qū)育苗圃(代號(hào)為a)、黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所(代號(hào)為b)、白城市林業(yè)科學(xué)研究院(代號(hào)為c)、肇州縣豐樂苗圃(代號(hào)為d)等單位提供(見表1)。

表1 40個(gè)楊屬品種詳細(xì)信息

1.2 試驗(yàn)方法

DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：采集不同品種楊樹新鮮葉片3～4片，完整放置于塑封袋內(nèi)，保存于實(shí)驗(yàn)室冰箱中(-20 ℃)。利用百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的新型快速植物基因組DNA提取試劑盒，提取楊樹基因組DNA，并取2 μL樣品，在質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行完整性檢測(cè)。

合成引物：查閱相關(guān)文獻(xiàn)及楊樹引物庫，委托蘇州金唯智生物科技有限公司(https://www.genewiz.com.cn/)合成21對(duì)SSR引物(見表2)。

SSR反應(yīng)體系的構(gòu)建：SSR-PCR所需的反應(yīng)液購買于北京百泰克生物技術(shù)有限公司，20 μL反應(yīng)體系，其中包含PCR預(yù)混液10 μL、前后端濃度10 μmol/L的引物各1 μL、模板DNA1 μL、超純水7 μL。PCR反應(yīng)在美國ABI公司的VERITI型PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)的熱循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性2 min，然后94 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物置于質(zhì)量濃度為30 g/L的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行初步檢測(cè)，判斷產(chǎn)物的有無。

表2 21對(duì)SSR引物序列信息

PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)：準(zhǔn)備潔凈的2塊玻璃板和等長(zhǎng)的1 mm厚梳子，用于質(zhì)量濃度為80 g/L的非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備(見表3)。待凝膠完全凝固后，吸取2～3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，與1 μL的上樣緩沖液均勻混合后點(diǎn)入上樣孔，于200 V恒定電壓下直至指示劑中的二甲苯青移動(dòng)至膠的2/3處時(shí)，停止電泳(約70 min)。之后，將聚丙烯酰胺凝膠放入預(yù)先配置好的約300 mL染色液(質(zhì)量濃度為2 g/L的AgNO3、體積分?jǐn)?shù)1%的冰乙酸、體積分?jǐn)?shù)10%的無水乙醇)中，在搖床上搖動(dòng)20 min，至電泳示蹤液消失后，倒入足量蒸餾水，清洗2次，每次15 s，取出瀝水。最后加入現(xiàn)用現(xiàn)配的顯影液(質(zhì)量濃度為30 g/L的NaOH、體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醛)300 mL，輕搖8 min，至目的條帶出現(xiàn)后拍照記錄各樣品的條帶情況。

表3 質(zhì)量濃度為80 g·L-1的非變性聚丙烯酰胺凝膠制備配方

1.3 數(shù)據(jù)處理

矩陣圖建立：采用人工數(shù)帶方式，將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)換成電子圖譜，根據(jù)電子圖譜制作0/1二維矩陣，多態(tài)性位點(diǎn)無條帶則記為0，有條帶則記為1，在Excel軟件中建立等位基因矩陣圖。

多態(tài)性條帶比率(Rpp)：Rpp=a/b，a為多態(tài)性條帶數(shù)、b為條帶總數(shù)。

遺傳相似性：利用NTSYS2.0.1軟件，通過非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析實(shí)現(xiàn)。

基因片段長(zhǎng)度：以DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物(DL2000)片段長(zhǎng)度對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的條帶遷移距離為橫坐標(biāo)，繪制DNA片段長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同等位基因的遷移距離用直尺測(cè)量后，帶回標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到較為準(zhǔn)確的各等位基因片段長(zhǎng)度的數(shù)值。

各品種楊樹的二維碼：將各品種自詳細(xì)的遺傳背景、引物信息、等位基因片段長(zhǎng)度等信息錄入二維碼。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性

利用21對(duì)SSR引物，對(duì)40份樣品的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終篩選出18對(duì)擴(kuò)增效率高、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、特異性高的SSR引物，進(jìn)行供試材料的指紋圖譜構(gòu)建及遺傳關(guān)系分析，引物編碼見表2。

利用選定的18對(duì)引物對(duì)40個(gè)楊樹品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，得到相應(yīng)的擴(kuò)增條帶。試驗(yàn)共獲得多態(tài)性條帶101條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出5.61條，多態(tài)性比率為100%。其中，引物PMGC_2030擴(kuò)增出10條條帶，數(shù)量最多，引物PN1297275、PMGC_2885均擴(kuò)增出3條條帶，數(shù)量最少，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度處于34～393 bp之間。引物PMGC-2679、PMGC_649、PMGC_2030、ORPM_248的電泳結(jié)果如圖1所示，各引物對(duì)40個(gè)樣品的擴(kuò)增情況見表4。

A為引物PMGC-2679、B為引物PMGC_649、C為引物PMGC_2030、D為引物ORPM_248；M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物(DL2000)；從左至右1～40為楊樹樣品序號(hào)，順序同表1。

試驗(yàn)結(jié)果顯示：不同品系分離得到的條帶的數(shù)量及所在位置不同，同一品系利用不同引物擴(kuò)增出的條帶也有所不同。說明利用這18對(duì)引物，可以將供試的40個(gè)楊樹品種區(qū)分開，實(shí)現(xiàn)了分子水平上各品種的辨別。

2.2 40個(gè)楊樹雜交品種的指紋圖譜構(gòu)建與分子二維碼的建立

圖2為引物PNI297272、PNI297275的分子片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線。分析18對(duì)引物的分子片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，其R2均在0.966 9～0.976 9之間，擬合度極好，可用于已知品種等位基因分子片段長(zhǎng)度的計(jì)算。

依據(jù)引物分子片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算有效條帶對(duì)應(yīng)的等位基因的分子片段長(zhǎng)度，繪制 40個(gè)楊樹品種的指紋圖譜(見表5)。為40個(gè)楊樹品種建立各自的專屬二維碼，具體信息包括：品種名稱、遺傳背景、拉丁名、品種類型、品種權(quán)人，以及利用試驗(yàn)選用的18對(duì)引物進(jìn)行SSR擴(kuò)增后的產(chǎn)物片段數(shù)量和片段長(zhǎng)度共7類信息(見圖3)。

表4 18對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 楊樹雜交品種的遺傳相似性

將統(tǒng)計(jì)出的40個(gè)試驗(yàn)材料的0/1矩陣圖進(jìn)行格式處理，利用Ntsys軟件進(jìn)行遺傳相似性分析(見表6)。40個(gè)楊屬品種(系)的遺傳相似系數(shù)的變化范圍在0.48～0.89之間，遺傳相似系數(shù)較好地反應(yīng)了各品種(品系)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

雜交親本分別為同一種的品種(品系)，其遺傳相似系數(shù)較大。如1302、1307、1309、1305均為小葉楊與黑楊的雜交子代，其中1302與1307、1309的遺傳相似系數(shù)均為0.89，表明利用篩選的18對(duì)引物，通過SSR方式， 1302獲得的分子指紋圖譜與1307、1309的指紋圖譜相似性極強(qiáng)，區(qū)分度最弱；1307與1309的遺傳相似系數(shù)為0.86，說明二者的相似性較其與1302的相似性稍弱些，區(qū)分度稍強(qiáng)些。而對(duì)于相同遺傳背景的1305與1302、1307、1309的遺傳相似系數(shù)分別為0.81、0.82、0.80，通過SSR指紋圖譜進(jìn)行區(qū)分，辨識(shí)度要更強(qiáng)一些。

同樣為小葉楊與黑楊雜交子代的8804、1310、1301、1303，彼此間的遺傳相似系數(shù)均在0.73以上，SSR指紋圖譜的相似性也較強(qiáng)。

由表6可見，同樣為小葉楊×黑楊的遺傳背景下，1309與8804、1305與8804、1309與1310、1302與1310的遺傳相似系數(shù)，分別為0.59、0.61、0.62、0.63。SSR的指紋圖譜相似性較弱，容易區(qū)分。

a為引物PNI297272的曲線；b為引物PNI297275的曲線。

表5 40個(gè)東北地區(qū)楊樹種的指紋圖譜

續(xù)(表5)

圖3 40個(gè)楊樹品種SSR擴(kuò)增片段二維碼

由表6可見，柔毛楊(原變種)(C38)和波蘭15號(hào)楊(C39)與其他品種(品系)的遺傳相似系數(shù)較小。具體為：柔毛楊與甜×俄(C18)的遺傳相似系數(shù)為0.49，與A118(C7)、香94(C10)、J7(C12)的相似系數(shù)均為0.51；波蘭15號(hào)楊(C39)與A118(C7)的遺傳相似系數(shù)為0.48，其與大青×健(C8)、斯大林工作者(C14)、斯×施(C16)的遺傳相似系數(shù)均為0.51。柔毛楊和波蘭15號(hào)楊，分別屬于青楊派原種和黑楊派雜種，2個(gè)品種與具有相同派別遺傳背景的品系的遺傳相似系數(shù)均較小，易于分辨。

表6 40個(gè)楊樹品種間的相似系數(shù)

續(xù)(表6)

品種編號(hào)C21C22C23C24C25C26C27C28C29C30C31C32C33C34C35C36C37C38C39C40C1?C20C211.00C220.831.00C230.770.761.00C240.610.580.661.00C250.620.630.710.731.00C260.740.690.730.630.681.00C270.660.750.750.650.680.741.00C280.640.610.630.770.680.620.681.00C290.680.630.650.730.680.640.680.781.00C300.630.660.640.720.650.590.710.730.871.00C310.710.680.660.740.650.670.710.850.790.801.00C320.690.620.620.600.570.690.610.570.650.600.661.00C330.660.610.670.610.620.620.680.600.620.610.670.771.00C340.690.680.680.680.610.670.710.650.710.740.660.780.731.00C350.660.650.670.670.600.640.700.660.720.730.630.730.740.891.00C360.750.720.620.620.570.670.610.610.730.680.700.800.710.820.811.00C370.630.640.680.660.590.650.650.590.690.720.620.720.750.860.890.80 1.00C380.640.570.550.550.680.580.600.520.640.590.590.650.660.630.620.690.611.00C390.600.550.570.630.660.540.620.580.620.570.530.610.600.630.640.590.570.721.00C400.740.690.710.630.600.680.660.600.640.650.610.710.740.790.800.730.810.610.661.00

對(duì)40個(gè)試驗(yàn)樣品的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析，繪制聚類分析樹狀圖(見圖4)。首先，父母本分別為同種的雜交楊樹品種聚為一類，如1307、1302、1309、1305父本均為小葉楊、母本均為歐洲黑楊，此4個(gè)品種為一組；8804、1310、1301、1303父本均為小葉楊，母本均為歐洲黑楊，這4個(gè)品種為一組；然后，遺傳相似系數(shù)處于0.74左右的品種再聚為一類。聚類過程中，母本效應(yīng)顯著，即相同母本的雜交品種首先聚為一類，再依據(jù)父本之間的遺傳差異形成不同的聚集情況，以白城2號(hào)楊(C4)、白城5號(hào)楊(C5)、白城小黑楊(C6)為例，白城2號(hào)楊(C4)和白城5號(hào)楊(C5)的父母本相同，則先在0.75水平聚為一類，再與母本相同而父本不同的白城小黑楊(C6)在0.73水平聚為同類。聚類分析表明，父母本均為同一種的雜交品系在較大遺傳相似系數(shù)的位置上聚為一類，父母本中有一方為相同種的物種間遺傳相似性系數(shù)也基本在0.73的水平上聚為一類，且母本效應(yīng)高于父本效應(yīng)。若一個(gè)楊樹品種的父本與另一品種的母本是相同品種樹種時(shí)，它們二者間的遺傳相似性也高于那些父母本完全不同的雜交品系。

圖4 40個(gè)楊樹品種的聚類分析

3 討論

品種的遺傳相似系數(shù)與遺傳背景密切相關(guān)。通常，品種的遺傳背景越相似，它們的遺傳相似系數(shù)越接近1。本研究中選取的40個(gè)楊屬雜交品種中，有34個(gè)是以小葉楊或黑楊為單一親本或父母本的，有15個(gè)是小葉楊×黑楊的雜交子代，表型相似性較強(qiáng)，分子水平上遺傳相似系數(shù)普遍較大。本研究中，白城小黑楊同樣是小葉楊×黑楊的雜交種，但該品種與其它小葉楊×黑楊雜交種的遺傳相似系數(shù)均較小，數(shù)值為0.56～0.74。其原因是，小葉楊與黑楊的雜交種，其父母本雖為同一種，但作為其親本的小葉楊或歐洲黑楊極可能為不同種源或相同種源的不同家系、不同單株，地理分布上的遠(yuǎn)緣性或種源內(nèi)家系間的遺傳多樣性，均有可能導(dǎo)致了分子水平上遺傳相似系數(shù)相對(duì)較小。在相關(guān)研究中，山楊[18]和密葉楊[19]等楊屬不同種，均表現(xiàn)出種源間或居群間遺傳變異遠(yuǎn)低于種源內(nèi)或居群內(nèi)個(gè)體間的遺傳變異。因此，推斷無論是否為相同種源，只要是不同的小葉楊或黑楊親本個(gè)體，便可導(dǎo)致其雜交種后代遺傳相似性的巨大差異。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別，對(duì)于植物分類學(xué)、林木遺傳育種以及表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究者頗為容易，卻不具有大眾范圍的普適性。楊樹天然雜交普遍，人工雜交容易，僅憑外部形態(tài)進(jìn)行辨種識(shí)種，專業(yè)性強(qiáng)，且受環(huán)境影響巨大，SSR分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)與普及，極好地解決了這一問題，該技術(shù)將在品種鑒別、良種保護(hù)等方面得到越來越廣泛的應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究以東北地區(qū)可廣泛栽培的已知楊樹品種為研究對(duì)象，利用篩選出的18對(duì)引物，對(duì)其進(jìn)行SSR擴(kuò)增分析，從DNA分子的角度上對(duì)40種試驗(yàn)材料進(jìn)行了鑒定辨別。同時(shí)利用試驗(yàn)結(jié)果形成了相應(yīng)的DNA指紋圖譜，并進(jìn)行了遺傳相似性分析與聚類分析，建立了40個(gè)已知品種的二維碼，豐富了楊屬分子基因庫信息，為后續(xù)品種名錄的建立與品種保護(hù)等工作奠定了基礎(chǔ)。