殷晨星，李澎濤，于曉光，邢鵬，王娜，師楠，孟娜娜，王玉真

輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)近年來得到了很快發(fā)展。Palermo等[1]1992年首次報道了卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(intracy toplasmic sperm injection，ICSI)，在一定程度上解決了因男性因素導致的不育。隨著顯微外科技術的不斷發(fā)展，Tournaye 等[2]1994年報道了使用睪丸精子抽吸術(testicular sperm aspiration,TESA)或經(jīng)皮附睪精子抽吸術(percutaneous epidydimal sperm aspiration,PESA)取出的精子行ICSI，這些技術使梗阻性無精子癥患者獲得自己的遺傳學后代成為可能。梗阻性無精子癥是指由于輸精管道的梗阻或者缺如使精子的運輸發(fā)生障礙，精子不能隨精液排出體外。梗阻性無精子癥約占男性不育的1%，在無精子癥中的發(fā)生率約為42%～48%[3-4]。

精子的發(fā)生是在睪丸、附睪內(nèi)進行，完成了成熟和修飾過程，在時間和空間上非常嚴格，即不同來源的精子在畸形率、DNA碎片率、頂體完整性、成熟度等方面具有差異[5]。關于不同來源的精子對ICSI的受精結(jié)局和妊娠結(jié)局是否有影響，有很大爭議。本文通過回顧性分析不同來源精子ICSI的受精和妊娠結(jié)局，旨在探討不同來源精子及其DNA碎片率和頂體完整性對ICSI受精和妊娠結(jié)局的影響，從而對臨床工作提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組

回顧性分析2017年5月至2020年5月于保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學科接受治療的185個ICSI新鮮周期，按精子來源分為3組。A組：診斷為嚴重少弱精子癥的男性患者的射出精液(95個周期)；B組：睪丸取精精子(57個周期)；C組：附睪取精精子(33個周期)。納入標準：① 均為男方不育行ICSI，女方經(jīng)檢查無不孕因素，年齡≤35歲；② 女方體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)18～25 kg/m2；③ 血清卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone，F(xiàn)SH)<10 mIU/mL；④ 雙方?jīng)]有染色體異常及Y染色體無精子因子(azoospermia factor,AZF)微缺失；⑤ 梗阻性無精子癥的診斷：至少 3次體外排出精液經(jīng)離心后顯微鏡檢均未發(fā)現(xiàn)精子，診斷性手術取精可見成熟精子；⑥ 非圓頭精子癥患者。

1.2 研究方法

1.2.1 PESA和TESA方法 TESA主要采用局部麻醉結(jié)合睪丸穿刺活檢獲取睪丸組織，置入含1 mL體外操作液(G-mops Plus,Vitrolife)的培養(yǎng)皿中，用1 mL注射器針頭將曲細精管切碎，倒置顯微鏡(×400)下，觀察是否有精子。PESA采用常規(guī)精索局部麻醉結(jié)合注射器抽吸法獲取附睪液，置入含1 mL體外操作液的培養(yǎng)皿中，倒置顯微鏡(×400)下，觀察有無精子。若有精子，取精術結(jié)束，將培養(yǎng)液置入15 mL離心管中，300 g/min離心，去上清，留0.2 mL沉淀，重復再洗一次，常溫備用。

1.2.2 促排卵方案 女方促排卵方案均為黃體期促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin-releasing hormone analogue，GnRH-a)長方案：黃體中期(排卵后的5～7 d，一般為月經(jīng)的第19～23 d)，給予短效GnRH-a(0.1 mg/d或0.05 mg/d，皮下注射)垂體降調(diào)節(jié)，降調(diào)節(jié)時間約14～16 d。降調(diào)節(jié)完畢后，測定體內(nèi)性激素，B超檢查雙側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)及大小。開始啟動促性腺激素(gonadotropin,Gn)，當至少有2～3個優(yōu)勢卵泡直徑達18 mm，并參考黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)，停用GnRH-a、促排卵藥，當晚肌注人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)5 000～10 000 IU，注射hCG 36 h后取卵。

1.2.3 精子DNA碎片指數(shù)的檢測 采用精子染色質(zhì)擴散試驗。精子DNA 碎片指數(shù)(DNA fragmentation index,DFI)是較穩(wěn)定的指標，DFI> 25%被認為是異常值?！?00 倍顯微鏡下觀察，根據(jù)光暈與精子頭部橫徑的比例，光暈寬度大于精子頭橫徑1/3，表示精子DNA完整無碎片；光暈寬度小于精子頭橫徑1/3，表示精子DNA有斷裂為碎片現(xiàn)象。精子DNA碎片率>25%視為異常。

1.2.4 精子頂體完整性檢測 采用豌豆凝集素熒光標記法(fluorescein isothiocyanate conjugated pisum sativum agglutinin，F(xiàn)ITC-PSA)，根據(jù)精子頭部熒光的部位和形態(tài)來判斷頂體完整性。精子遠離頸部的頭部約1/2以上熒光染色明亮且均勻，說明頂體完整；精子僅在赤道帶出現(xiàn)熒光帶，或頂體區(qū)沒有熒光染色，說明已發(fā)生頂體反應；除上述兩類精子外的所有精子為頂體異常精子。將精子頂體完整性<90%，視為頂體異常。

由于這3組來源的精子數(shù)量都比較少，所以取ICSI操作之后，將剩余含有精子的培養(yǎng)液離心，取精子沉淀，進行實驗操作，至少計數(shù)精子100條。

1.3 相關分析指標

受精率=正常受精卵數(shù)/MⅡ卵數(shù)×100%；卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/正常受精卵數(shù)×100%；優(yōu)胚率=優(yōu)胚數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%；臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。移植14 d后，檢驗血β-hCG，了解是否妊娠，6周后B超示可見孕囊確診為臨床妊娠。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般情況比較

共納入185個新鮮移植 ICSI 周期。女方平均(29.1±2.8)歲，女方基礎FSH平均值為(8.1±0.9)mIU/mL；3組在女方年齡、男方年齡、基礎 FSH 水平、獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)等方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表1。

2.2 3組精子DNA碎片指數(shù)、頂體完整性和助孕結(jié)局比較

B組DFI明顯低于A組和C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；3組頂體完整性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。A組、B組的2PN率高于C組，A組的2PN卵裂率、優(yōu)胚率明顯高于B、C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；3組妊娠率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2。

3 討論

不孕不育中約50%是男性因素[6]，其中主要包括嚴重少精子癥、弱精子癥及梗阻和非梗阻性無精子癥等。在ART中，ICSI是治療男性不育的一個重要有效手段。梗阻性無精子癥患者可以通過PESA/TESA來獲取附睪/睪丸精子。而不同來源的精子對ICSI后胚胎的發(fā)育和妊娠結(jié)局一直是臨床工作者和胚胎學家關心的問題。解決這個問題需要追溯到精子的發(fā)生和精子相關分析。精子發(fā)生場所為睪丸的曲細精管，精子在睪丸形成過程中，經(jīng)過了脫除細胞質(zhì)和質(zhì)膜重構(gòu)等對受精至關重要的過程。精子膜重構(gòu)決定了透明質(zhì)酸酶和透明帶受體的形成[7]。精子進入附睪后，在附睪內(nèi)進一步成熟，獲得一些功能，主要包括：精子的運動能力和受精能力等[8]。因此不同來源精子在功能相關方面可能存在差異，比如精子DFI和頂體完整性方面。

不同來源的精子對ICSI后胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響爭議不斷，有學者認為睪丸精子的受精率、優(yōu)胚率比附睪精子低，但附睪精子、睪丸精子及射出精子經(jīng)過ICSI治療后妊娠結(jié)局并無統(tǒng)計學差異[9-10]。有學者研究結(jié)果為睪丸精子組2PN受精率、卵裂率明顯低于手淫精子組與附睪精子組，附睪精子組臨床妊娠結(jié)局優(yōu)于射精組及睪丸精子組，建議首選附睪取精[11]。還有學者研究認為對于梗阻性無精子癥患者，睪丸精子和附睪精子行ICSI后可達到相似的妊娠結(jié)局，臨床上可結(jié)合患者情況選擇不同的取精方式[12]。而近期有一部分學者研究結(jié)果則證實睪丸精子較射出精子可獲得更高的胚胎著床率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率[13]。最新研究認為睪丸精子組可移植胚胎明顯高于附睪精子組，但治療結(jié)局無差異[14]。

本文研究結(jié)果顯示睪丸精子組的DFI顯著低于重度少弱精子癥患者手淫精子組(以下稱“手淫精子組”)和附睪精子組。經(jīng)過ICSI治療后，手淫精子組和睪丸精子組的2PN率顯著高于附睪精子組，差異有統(tǒng)計學意義，這與多數(shù)學者的結(jié)果不盡一致。

睪丸精子中有一些物質(zhì)避免精子過度成熟[15]；精子DNA損傷多發(fā)生于睪丸后階段，精子在附睪體中存留時間較長，導致精子活力下降，老化死亡精子較多，活性氧過多損傷精子DNA[16-17]。再加之梗阻性無精子癥患者精子長時間在附睪中淤積阻滯，不利于附睪精子的成熟發(fā)育，而且梗阻性無精子癥多為炎癥引起的梗阻，附睪內(nèi)炎性物質(zhì)及氧化應激容易導致精子損傷，因此理論上睪丸精子 DNA損傷要小于附睪與精液中的精子[18-19]，本文結(jié)果也支持這一理論。精子DFI代表了精子基因的完整性和表觀遺傳學水平的正確性，直接影響了精卵是否能成功進行正常受精。這和本文中的睪丸精子組2PN率要高于附睪精子組的結(jié)果是一致的。而手淫精子組也高于附睪精子組，分析原因，可能是射出精子的成熟度要比附睪精子高。DNA損傷對后代安全性也有一定的影響[20]，有學者通過應用轉(zhuǎn)基因小鼠-Big Blue這種公認的突變檢測模型研究發(fā)現(xiàn)，精子DNA損傷對子代遺傳及表觀遺傳的穩(wěn)定性影響很大[21]。還有學者認為精子DFI與復發(fā)性流產(chǎn)具有顯著相關性，復發(fā)性流產(chǎn)患者配偶DFI高于配偶無復發(fā)性流產(chǎn)史的生育男性[22]。

表1 3組患者一般資料比較

表2 3組DFI、頂體完整性和助孕結(jié)局比較[%(個)]

精子頂體完整性高除了在精卵自然結(jié)合過程中更有利于精子經(jīng)過透明帶與卵子完成受精反應外，在ICSI過程中還有利于精子通過發(fā)生鈣離子激活反應激活卵子，從而完成受精[23]。目前關于頂體對輔助生殖結(jié)局影響的報道大部分是圓頭精子癥患者的案例，細胞內(nèi)鈣水平升高是精卵結(jié)合所必需的，然而圓頭精子不能或者不能完全觸發(fā)細胞內(nèi)鈣增加導致精子結(jié)合能力喪失或者降低[24]。ICSI可成功治療圓頭精子癥，但受精率低，其原因可能是卵母細胞活化因子降低。本文中入選患者為非圓頭精子癥患者，且大多數(shù)注射進入卵母細胞的精子都是具有完整頂體的，排除了精子鈣離子對卵子激活的影響。本研究顯示頂體完整性在3組間差異無統(tǒng)計學意義，經(jīng)過ICSI治療后，手淫精子組和睪丸精子組的2PN率顯著高于附睪精子組，差異有統(tǒng)計學意義。這說明，經(jīng)ICSI治療后，不同來源的非圓頭精子對胚胎發(fā)育的影響不是由頂體完整性這個因素導致的。

本文中手淫精子組的2PN卵裂率、優(yōu)胚率明顯高于睪丸精子組、附睪精子組；睪丸精子組與附睪精子組相比，2PN卵裂率、優(yōu)胚率差異都不明顯。3組妊娠率比較差異無統(tǒng)計學意義。雖然手淫精子組2PN卵裂率、優(yōu)胚率要高于睪丸精子組和附睪精子組，但最終的妊娠結(jié)局沒有受到影響。這也可能跟樣本數(shù)量有限、女方各種因素的差異性有關，我們期待今后收集更充分、有效的樣本，做更科學、前瞻性的研究。

綜上所述，ICSI選擇不同來源的精子中，睪丸精子能達到手淫精子相似的胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局。如果不能得到手淫精子，由于睪丸精子DNA損傷要小于附睪精子，對后代的安全性可能更高；而且睪丸精子的正常受精率要高于附睪精子，因此可以優(yōu)先選擇睪丸精子行ICSI。