董真真 袁 峰 白 倩

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州450003

腦缺血疾病是臨床一種常見病、多發(fā)病，主要有效治療方法為早期恢復(fù)缺血半暗帶血供，但血管再通后其功能尚不能恢復(fù)，卻出現(xiàn)腦功能損害加重的情況即為腦缺血再灌注損傷。腦灌注損傷是決定疾病預(yù)后的重要因素，因此如何最大程度降低其損害，提高神經(jīng)元的存活率成為研究腦灌注損傷的主要課題。腦缺血再灌注損傷是一種多機制、多因素介導(dǎo)的細胞凋亡、神經(jīng)受損過程。谷氨酸、門冬氨酸等興奮性氨基酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明，興奮性氨基酸在腦缺血再灌注后釋放增加，是腦缺血再灌注損傷的重要機制［1］，對腦組織的損害作用是通過作用于相應(yīng)的受體而產(chǎn)生。谷氨酸受體包括離子型受體和代謝型受體，離子型受體直接激活受體使離子通道開放，代謝型受體通過激活G 蛋白和第二信使間接使離子通道開放，其中N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NMDAR）是最重要的谷氨酸離子型受體，興奮性氨基酸通過作用于NMDAR 使大量Ca2+內(nèi)流，致細胞內(nèi)Ca2+超載，進而引起一系列病理變化致神經(jīng)細胞死亡。研究表明，NMDAR 參與興奮性氨基酸的毒性作用，在局灶腦缺血再灌注后表達增加［2］。因此，抑制NMDAR 的表達有可能降低腦缺血再灌注損傷。NMDAR 抑制劑分為競爭性拮抗劑和非競爭性拮抗劑，如地卓西平和氯胺酮被證實能減輕缺血后腦損傷［3-4］，但同時會引起神經(jīng)元空泡形成，造成行為和認知等精神癥狀的不良反應(yīng)［5］。NMDAR 有3 種亞基：NMDAR1、NMDAR2、NMDAR3，其中NMDAR1 是Ca2+通道的調(diào)節(jié)者，是介導(dǎo)谷氨酸興奮毒性的主要組分［6］。

烏司他丁是一種能抑制多種蛋白水解酶活力的蛋白酶抑制劑，常用于急性胰腺炎、循環(huán)衰竭的救治。研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁能降低圍術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，從而保護心、肝、腎等重要臟器功能［7］；也可減輕小鼠腦缺血再灌注損傷［8］，用于缺血再灌注損傷能夠減少氧自由基的釋放和Ca2+內(nèi)流，降低Ca2+超載及興奮性氨基酸的釋放［9］。本研究擬通過探討烏司他丁對大鼠腦缺血再灌注時海馬NMDAR1表達的影響評價其神經(jīng)保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組：清潔健康雄性SD 大鼠72 只（河南實驗動物中心），體質(zhì)量220～280 g，將大鼠隨機分為假手術(shù)組（S組）、腦缺血再灌注組（I/R組）、烏司他丁干預(yù)組（U組），每組24只。

1.1.2 主要儀器和試劑：RT-PCR 圖像分析系統(tǒng)（賽沛GeneXpert Infinity）；PCR 儀（美國，Applied Biosystems），電泳儀（北京市六一儀器廠，DYY-11），圖像采集系統(tǒng)（VisionBank SVS），烏司他丁（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字號H19990133），TUNEL 試劑盒（羅氏ZK 8005），PCR 試劑盒（DRR036A PrimeScript，大連寶生物工程有限公司），兔抗大鼠NMDAR1 多克隆抗體（Sigma 公司，美國），免疫組化試劑盒（SABC 試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司），DAB顯色試劑盒（上?？道噬锛夹g(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注模型的制備：參照LONGA等［10］線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血模型。禁食、禁水12 h，用10%水合氯醛3.5 mL/kg 進行腹腔注射麻醉，將大鼠放在操作臺上，仰臥固定四肢，取頸部正中切口，剪開皮膚、鈍性分離組織肌肉，暴露頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈，將線栓經(jīng)頸總動脈插入頸內(nèi)動脈約20 mm 固定，清創(chuàng)縫合傷口。缺血2 h后再緩慢拔出栓子，使栓子頭端回到頸內(nèi)動脈起始部，恢復(fù)組織灌注。S組僅暴露右側(cè)頸總動脈后縫合，不做其余處理。U組于再灌注即刻腹腔注射注射烏司他丁20 000 U/kg，S 組及I/R 組用相同劑量的生理鹽水替代。

1.2.2 神經(jīng)功能評分（NDS）：參照LONGA［4］的評分方法，再灌注3 h 后觀察并記錄神經(jīng)功能缺失癥狀；無神經(jīng)損傷征象為0分，不能完全伸展健側(cè)前肢為1分，行走時向健側(cè)旋轉(zhuǎn)征象為2 分，向健側(cè)跌倒為3分，無自發(fā)活動及意識障礙者為4分，1～3分為模型制作成功。記錄各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分。

1.2.3 凋亡細胞數(shù)的檢測：NDS完成后，每組隨機抽取8 只大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后，快速斷頭取腦，取病變側(cè)視交叉后2～4 mm做冠狀切片，連續(xù)制成厚約5 μm 的切片。按照TUNEL 法試劑盒步驟操作，胞核染成棕褐色即為陽性細胞。將每只大鼠均勻切片，隨機選擇不連續(xù)的切片5 張，每張切片的5個不同視野在400倍鏡下進行觀察并計數(shù)，隨后求其平均數(shù)。

1.2.4 RT-PCR 檢測海馬神經(jīng)元NMDAR1 mRNA 水平的表達：NDS完成后，每組隨機抽取8只大鼠，迅速斷頭取腦，將腦組織研磨提取RNA，按照TaKaRa RNA PCR試劑盒步驟進行。以cDNA模板行PCR擴增：NMDAR1（512 bp）上游引物：5’-GACTATACCAGCCGAATAAGCG-3’，下游引物：5’-CTGCTACAGCAGACTCGTCACAT-3’。加入適量的ddH2O，使體積增大，輕輕混勻、離心。設(shè)定PCR 程序，在適當(dāng)?shù)臏囟葦U增30個循環(huán)，于PCR儀中獲取所需要的產(chǎn)物，行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析儀對結(jié)果進行觀察、拍照，并測定每條帶的積分光密度值。

1.2.5 采用免疫組化法檢測NMDAR1 的蛋白表達：NDS 完成后，各組取8 只大鼠，取視交叉神經(jīng)起點處前后各2 mm 的冠狀切片，放入4%多聚甲醛中4 ℃固定18 h，經(jīng)15%、20%和30%的蔗糖梯度脫水后在Leica 冰凍切片機上連續(xù)切片，片厚15 μm。免疫組化染色：切片后依次用4%多聚甲醛固定40 min，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、山羊血清各40min，滴加稀釋的兔抗NMDAR1 多克隆抗體（1∶500）浸泡于4 ℃的濕盒過夜，洗膜后加入鏈酶親和素過氧化物酶37 ℃30 min 進行二抗反應(yīng)；然后加入新鮮配制的DAB 顯色液鏡下觀察5 min，用1%蘇木素復(fù)染，蒸餾水沖洗、脫水，中性樹膠封片，光鏡下觀察觀察缺血側(cè)海馬CA1區(qū)NMDAR1的表達，用計算機自動圖像分析軟件計算缺血再灌注側(cè)海馬區(qū)NMDAR1 表達的平均光密度值（mean optical density，MOD）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 烏司他丁對大鼠神經(jīng)功能和腦梗死體積組織凋亡細胞數(shù)的影響 與S組比較，I/R 組和U組NDS評分和腦組織凋亡細胞數(shù)增加（P＜0.05）；與I/R 組比較，U 組NDS 評分和腦組織凋亡細胞數(shù)降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 烏司他丁對缺血再灌注大鼠海馬CA1 區(qū)NMDR1 mRNA 水平表達和NMDAR1 蛋白表達的影響 與S 組比較，I/R 組NMDAR1 mRNA 表達上調(diào)和NMDAR1 表達的MOD 值升高（P＜0.05）；與I/R 組比較，U 組NMDAR1 mRNA 表達下降和NMDAR1 表達的MOD值降低（P＜0.05）。見圖1～2、表2。

表1 3組大鼠NDS評分和腦組織凋亡細胞數(shù)比較 （±s）Table 1 Comparison of NDS and the number of apoptotic cells in three groups of rats （±s）

表1 3組大鼠NDS評分和腦組織凋亡細胞數(shù)比較 （±s）Table 1 Comparison of NDS and the number of apoptotic cells in three groups of rats （±s）

注：與S組比較，▲P＜0.05；與I/R組比較，●P＜0.05

組別S組I/R組U組t值P值凋亡細胞數(shù)（個/HP）0 52.1±3.25▲26.4±2.70▲●5.612 0.012 7 n888 NDS評分（分）0 2.58±0.35▲1.34±0.41▲●0.704 0.020 5

表2 3組大鼠海馬CA1區(qū)NMDR1 mRNA水平和NMDAR1表達MOD值比較 （±s）Table 2 Comparison of the expression of NMDR1 mRNA and the MOD value of NMDAR1 expression in the hippocampal CA1 region of the three groups of rats （±s）

表2 3組大鼠海馬CA1區(qū)NMDR1 mRNA水平和NMDAR1表達MOD值比較 （±s）Table 2 Comparison of the expression of NMDR1 mRNA and the MOD value of NMDAR1 expression in the hippocampal CA1 region of the three groups of rats （±s）

注：與S組比較，★P＜0.05；與I/R組比較，■P＜0.05

組別S組I/R組U組t值P值MOD值0.006 6±0.000 7 0.059 4±0.011 1★0.006 8±0.000 4★■3.241 0.021 7 n888 NMDR1 mRNA 0.890 2±0.013 6 1.039 8±0.021 1★0.907 3±0.014 2★■0.437 0.046 1

圖1 各組大鼠海馬組織中NMDAR1 mRNA的表達Figure 1 Expression of NMDAR1 mRNA in the hippocampus of rats in each group

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一種多因素導(dǎo)致細胞發(fā)生腫脹、破裂、凋亡的復(fù)雜病理過程［11］，其機制可能包括興奮性氨基酸的毒性作用、氧自由基釋放、線粒體功能障礙、炎癥介質(zhì)生成、Ca2+超載以及血管通透性改變等［12］。興奮性氨基酸是中樞系統(tǒng)正常的興奮性遞質(zhì)，包括谷氨酸和天冬氨酸，其中谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性遞質(zhì)，參與突觸興奮傳導(dǎo)，影響腦功能包括認知、和學(xué)習(xí)記憶功能［13］。正常情況下，興奮性氨基酸的產(chǎn)生、攝取和重吸收維持著動態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)缺血、缺氧或創(chuàng)傷等損害因素下能促其過度釋放產(chǎn)生毒性作用，損傷腦組織［14］，其機制為大量興奮性氨基酸釋放引起Na+、Cl-內(nèi)流、K+外流，導(dǎo)致細胞水腫、變性，蛋白質(zhì)降解，從而造成不可逆的線粒體壞死和細胞死亡［15-16］。

圖2 3組海馬CA1區(qū)NMDAR1的表達Figure 2 Expression of NMDAR1 in CA1 region of hippocampus in three groups

興奮性氨基酸對神經(jīng)細胞產(chǎn)生的毒性作用主要通過相應(yīng)的受體產(chǎn)生。NMDAR 是一種門控型離子型受體，對Mg2+有電壓依賴的阻斷作用，有谷氨酸和甘氨酸的結(jié)合位點，對Ca2+、Na+、K+均有通透性，因此是最重要的興奮性氨基酸受體。NMDAR 廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中以海馬、大腦皮質(zhì)和小腦最為豐富［17］。研究表明，腦缺血再灌注后NMDAR的毒性作用可致記憶細胞發(fā)生壞死，也可發(fā)生細胞的延遲死亡［18］。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后損傷后，NMDAR1 mRNA 含量增多和NMDAR1 表達增加［19］。既往將NMDAR 拮抗劑應(yīng)用于動物模型中研究其抗缺血、缺氧、預(yù)防神經(jīng)元變性的作用，但發(fā)現(xiàn)該拮抗劑可損傷呼吸和心血管系統(tǒng)或引起精神系列癥狀［5］，限制了其臨床應(yīng)用。目前已證實NMDAR 有3 種亞基：NMDAR1、NMDAR2、NMDAR3，分別有不同的分布和功能。其中NMDAR1 是Ca2+通道的調(diào)節(jié)者［20］，在腦缺血再灌注中與過量的谷氨酸結(jié)合，神經(jīng)元去極化，大量的Ca2+通道開放，致細胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體膜損傷，能量生成障礙，產(chǎn)生白三烯、前列腺素等炎性介質(zhì)，進而引起細胞死亡［21］。研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定預(yù)處理可減少缺血再灌注損傷時興奮性氨基酸的釋放和NMDA受體亞單位NRl的表達而產(chǎn)生腦保護作用［22］，布美他尼降低缺血再灌注損傷可能與降低NMDAR1的表達有關(guān)［23］。本研究通過檢測轉(zhuǎn)錄水平NMDAR mRNA 和翻譯水平NMDAR 蛋白的表達可以評估對神經(jīng)細胞的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，腦皮質(zhì)NMDAR1 mRNA 在短暫大腦缺血后再灌注24 h顯著增加［24］。也有研究表明，NMDAR1 表達在缺血再灌注3 h 達高峰，然后逐漸下降，12～24 h 后恢復(fù)正常［25］。因此，本研究選擇灌注3 h 作為觀察點，結(jié)果顯示I/R 組NMDAR mRNA 和NMDAR 蛋白的表達上調(diào)，與以往研究結(jié)果一致。

烏司他丁是從新鮮人尿中提取的一種能抑制多種蛋白水解酶的蛋白酶抑制劑。研究表明烏司他丁能緩解圍術(shù)期應(yīng)激，抑制炎癥因子和自由基的釋放，對心臟、肝臟等重要臟器的缺血再灌注損傷具有保護作用［26］，對中樞的保護作用也已得到證實［27］，但其保護機制尚未完全闡明［28］。LI等［29］通過研究烏司他丁對代謝型谷氨酸受體Ⅱ表達的影響評價其腦保護作用；LI等［8］發(fā)現(xiàn)烏司他丁通過抑制炎癥介質(zhì)的生成發(fā)揮腦保護作用。本研究參照文獻［1］制備腦缺血再灌注模型，結(jié)果顯示I/R組NDS評分和細胞凋亡數(shù)增加，說明模型制備成功。U組在灌注即刻給予烏司他丁，結(jié)果顯示U 組較I/R 組NDS 和細胞凋亡數(shù)下降，說明減輕了腦組織的損傷，與以往研究結(jié)果相同。U組與I/R組比較，NMDAR1 mRNA表達下降和NMDAR1蛋白表達的MOD值降低，說明烏司他丁下調(diào)了NMDAR1 蛋白的表達，可能機制為谷氨酸等興奮性氨基酸通過受體起作用，受體的活性或數(shù)目影響其效能，NMDAR作為谷氨酸的主要受體可能被烏司他丁所抑制；烏司他丁有清除氧自由基和抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用［30］，腦組織缺血早期NMDAR即被激活，大量Ca2+內(nèi)流致細胞內(nèi)鈣超載，進一步引起自由基的產(chǎn)生，烏司他丁降低了此種損傷，但確切的機制還有待進一步的研究。

烏司他丁減輕腦缺血再灌注損傷的機制可能與抑制NMDAR1表達有關(guān)，但不同劑量、不同時間點對神經(jīng)細胞的作用以及遠期效果還待進一步的研究，從而為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。