林明輝, 曾偉, 柯沛強(qiáng)

茂名市林業(yè)科學(xué)研究所，廣東 茂名 525000

薇甘菊（Mikania micrantha）為菊科藤本植物，通過(guò)攀緣并形成厚毯狀枝葉層覆蓋宿主植物，使宿主植物不能進(jìn)行正常光合作用而衰亡。在2002 年被列入中國(guó)首批外來(lái)入侵物種名錄，目前主要通過(guò)人工鏟除和化學(xué)除草劑處理，成本高，效率低下，控制時(shí)間短，除草劑對(duì)宿主植物造成傷害且污染環(huán)境，控制效果差。

據(jù)國(guó)外報(bào)道，薇甘菊柄銹菌具有生防潛力[1]，國(guó)內(nèi)有關(guān)引進(jìn)柄銹菌利用文獻(xiàn)報(bào)道不少，也取得了較好的效果，但未推廣應(yīng)用，且外來(lái)物種的入侵風(fēng)險(xiǎn)仍難以消除[2-4]，程偉文報(bào)道了豆莢大莖點(diǎn)霉對(duì)薇甘菊的生防潛力，但仍處于試驗(yàn)階段[5]。

在薇甘菊為害區(qū)域調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其葉片上有一種葉斑病，侵染葉片造成葉斑及葉枯，偶發(fā)侵染莖干造成枝枯，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，薇甘菊生長(zhǎng)明顯衰退，具備作為以菌防草研究的可能。本研究通過(guò)對(duì)薇甘菊葉斑病病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化、致病性測(cè)定、病原鑒定、生物學(xué)特性和寄主范圍測(cè)定的研究，旨在明確病原菌，探究病原菌培養(yǎng)特性及對(duì)本地主栽農(nóng)作物、水果、經(jīng)濟(jì)作物安全性，從而為該菌的利用提供初步參考。

1 材料與方法

1.1 材料

薇甘菊病葉采自化州市良光鎮(zhèn)長(zhǎng)安村，薇甘菊覆蓋桉樹(shù)及橡膠林地邊緣圍園灌木，部分攀爬桉樹(shù)及橡膠樹(shù)，微甘菊新葉葉斑病發(fā)生率35%～65%，按常規(guī)方法對(duì)病害癥狀進(jìn)行描述，并拍照。多點(diǎn)采集具備典型癥狀的葉片，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室，采樣時(shí)間為2018 年4 月至5 月，晴天下午采樣，共采樣3次，每次采集葉片10 片。

1.2 菌株的分離及純化

采用常規(guī)病原體分離法進(jìn)行分離[6]，共分離50 皿150 個(gè)葉片組織塊。對(duì)所分離出的真菌菌落采用瓊脂平板稀釋純化法進(jìn)行純化[7]，并將純化菌株轉(zhuǎn)入試管斜面，保存于4 ℃冰箱內(nèi)。

1.3 致病性測(cè)定

將1.2 純化的菌株共7 株接到PDA 培養(yǎng)基上，置于自然光照培養(yǎng)室25 ℃±1 ℃培養(yǎng)2 d，在無(wú)病薇甘菊葉片中央采用無(wú)傷離體接種菌絲塊，每片葉接種1 個(gè)直接0.4 cm 菌餅，并以接種無(wú)菌PDA 培養(yǎng)基為對(duì)照，參試菌株7 個(gè)，每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)接種5 片葉片，保濕并室溫培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。若接種葉片發(fā)病則再分離，完成柯赫法則驗(yàn)證。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)鑒定

將病原菌（1.3 回接發(fā)病的菌株共1 個(gè)）接種于PDA 培養(yǎng)基上，置于自然光照培養(yǎng)室25 ℃±1 ℃培養(yǎng)3 d，觀察病原菌菌落形態(tài)、產(chǎn)孢情況、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)并測(cè)量拍照。

1.4.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定

病原菌分子鑒定方法參照鄭樊[8]。

1.5 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

根據(jù)華南地區(qū)氣溫及病害發(fā)病規(guī)律，設(shè)置15、21、24、27、30、33、36 及42 ℃等8 個(gè)溫度值進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)。使用直徑0.4 cm 菌餅接種，培養(yǎng)5 d 后用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，比較溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.6 病原菌寄主范圍測(cè)定

寄主范圍測(cè)定以本地主栽農(nóng)作物、水果和經(jīng)濟(jì)作物作為參試物，包括水稻、木薯、香蕉、龍眼、芒果、桉樹(shù)、橡膠、甘蔗和桑樹(shù)等。以菌絲段懸浮液噴霧無(wú)傷活體接種，將直徑10 cm 培養(yǎng)皿長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲的培養(yǎng)基取出，加水200 mL，使用料理機(jī)打碎，過(guò)濾，加水定容為500 mL，即得接種用菌絲段懸浮液，傍晚噴霧，每個(gè)參試作物接種3 次，每次噴霧5 個(gè)接種點(diǎn)，完全噴濕接種部位葉片表面，噴霧后5 d，觀察記錄發(fā)病情況，包括病斑形狀、大小、顏色、深度和病征，如出現(xiàn)侵染，在接種后15 d，觀察是否出現(xiàn)未噴霧葉片感染，即是否出現(xiàn)再侵染。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

薇甘菊葉斑病能入侵薇甘菊，使葉片、葉柄及未老化莖產(chǎn)生病變，初期為黃褐色點(diǎn)狀病斑（見(jiàn)圖1A），后逐漸擴(kuò)大，近圓形或沿葉脈、側(cè)脈擴(kuò)展成不規(guī)則形病斑，病斑中央植物組織易失去水分而干枯、變薄、易裂、穿孔（見(jiàn)圖1B 和C）。葉柄及枝條的病斑初期為褐色小點(diǎn)、略凹陷，后期不斷擴(kuò)大呈長(zhǎng)條形褐色病斑，直至環(huán)繞枝條一圈。病葉保濕情況下，肉眼或用放大鏡觀察未見(jiàn)小黑點(diǎn)等其他病癥。

2.2 病原菌致病性測(cè)定

分離純化菌株回接只有1 個(gè)致病，其余菌株和對(duì)照不發(fā)病。接種后第3 天癥狀開(kāi)始出現(xiàn)（見(jiàn)圖2A），發(fā)病初期接種點(diǎn)呈黑色壞死，病健交界明顯，隨后病斑繼續(xù)擴(kuò)展，初期發(fā)病部位組織壞死分解（見(jiàn)圖2B），將該菌菌落活體接種至薇甘菊無(wú)菌苗，表現(xiàn)為葉片及莖段發(fā)病，與田間觀察到的癥狀相似（見(jiàn)圖2C）。

2.3 病原菌形態(tài)

培養(yǎng)性狀及形態(tài)在PDA 上菌落圓形，邊緣未老熟菌絲白色，老熟后菌絲呈黃色，菌落整體顏色初期白色后變黃褐色至深褐色（見(jiàn)圖3A）。在PDA上不產(chǎn)孢，將菌絲接種于薇甘菊無(wú)菌苗可產(chǎn)生分生孢子器和分生孢子。

圖1 薇甘菊葉斑病癥狀Fig.1 Symptoms of Mikania micrantha leaf spot

圖2 病原菌致病性測(cè)定Fig.2 Pathogenicity test of pathogenic bacteria

分生孢子器黑色、扁球形至球形（見(jiàn)圖3 C 和D），直徑60.2～185.3 μm×72.8～159.2 μm，分生孢子橢圓形到卵圓形，無(wú)色，單胞，頂端鈍圓（見(jiàn)圖3 B），分生孢子大?。?.9～7.1 μm×1.3～3.2 μm。

2.4 薇甘菊葉斑病病原系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)ⅠTS 對(duì)引物對(duì)菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、測(cè)序，得到長(zhǎng)度分別為516 bp 的序列。將得到的序列在GenBank 中進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，經(jīng)MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的各個(gè)分支的支持強(qiáng)度通過(guò)1 000 次重復(fù)的自展檢驗(yàn)數(shù)值進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株（WGJ）與Boeremia exigua聚為一個(gè)進(jìn)化枝（見(jiàn)圖4），支持率為100%。依據(jù)形態(tài)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，葉斑病病原菌經(jīng)鑒定為Boeremia exigua。

2.5 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果看出，15～27 ℃范圍內(nèi)，該病原菌菌落直徑隨溫度升高逐漸增大；27～42 ℃范圍內(nèi)，菌落直徑隨溫度升高逐漸減小。菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為24～33 ℃，最適溫度27 ℃，42 ℃時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)，菌落直徑與接入菌餅直徑相同（見(jiàn)圖5）。

2.6 病原菌寄主范圍測(cè)定

經(jīng)菌絲段懸浮液噴霧接種，除桑樹(shù)出現(xiàn)少量病斑，其余參試作物均未出現(xiàn)被侵染癥狀（見(jiàn)表1）。

由表1 可知，所有參試作物，均未出現(xiàn)致死，僅桑樹(shù)輕度發(fā)病，并未發(fā)現(xiàn)再侵染。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過(guò)對(duì)葉斑病的診斷和病原菌形態(tài)觀察測(cè)定，包括分生孢子器形態(tài)，分生孢子形狀、分生孢子大小，根據(jù)鑒定結(jié)果查閱相關(guān)資料[9]，初步鑒定薇甘菊葉斑病病原菌為Boeremia屬真菌，依據(jù)形態(tài)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，葉斑病病原菌經(jīng)鑒定為大豆莖點(diǎn)霉Boeremia exigua。病原菌菌絲生長(zhǎng)適宜溫度為24～33 ℃，最適溫度27 ℃，與野外觀測(cè)發(fā)生季節(jié)一致。

病原菌寄主范圍測(cè)定顯示可侵染桑樹(shù)，韋海玲報(bào)道Boeremia exigua可致桑斷枝爛葉病[10]，本研究接種未發(fā)現(xiàn)再侵染，具體原因有待進(jìn)一步研究。王夢(mèng)奇報(bào)道，Boeremia exigua可導(dǎo)致大豆莖點(diǎn)霉葉斑病[11]，但大豆非本地主要作物，未開(kāi)展試驗(yàn)。本研究過(guò)程中在使用菌絲懸浮液噴灑薇甘菊過(guò)程中，薇甘菊宿主團(tuán)花樹(shù)（Neolamarckia cadamba(Roxb.)Bosser）出現(xiàn)葉斑癥狀，亦無(wú)再侵染現(xiàn)象發(fā)生。

圖4 基于ⅠTS 序列構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Construction of ML phylogenetic tree based on ⅠTS sequences

圖5 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of temperature on mycelia growth

谷祖敏報(bào)道草莖點(diǎn)霉(Phoma herbarum)具備作為生物除草劑防除鴨跖草的潛力，且生物安全性良好和環(huán)境安全性良好[12]。Marcinkowska J 認(rèn)為，Boeremia exigua為多主寄生真菌，無(wú)寄主專(zhuān)化現(xiàn)象[13]。本研究對(duì)本地主要農(nóng)作物等開(kāi)展的寄主范圍測(cè)定結(jié)果顯示，大豆莖點(diǎn)霉寄主選擇性較好，具備進(jìn)一步開(kāi)展生物除草劑研究的潛力。

表1 病原菌接種不同作物發(fā)病情況Tab.1 Host range determination of pathogenic bacteria