趙新哲， 王紹霞， 高 晶， 王 璐

(東華大學(xué) 紡織學(xué)院， 上海 201620)

皮膚作為人體面積最大的器官，承擔(dān)了抵御外界傷害，調(diào)整人體內(nèi)溫度和體液以及免疫防御的功能[1]。當(dāng)皮膚損傷時(shí)，正常情況下機(jī)體會(huì)啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制以恢復(fù)皮膚結(jié)構(gòu)和功能的完整性。創(chuàng)面修復(fù)過程大概可分為：止血階段、炎癥反應(yīng)階段、細(xì)胞增殖階段和成熟階段，但一部分燒傷傷口、深度的急性傷口以及潰瘍、壓瘡等會(huì)使傷口愈合過程失去有序調(diào)控能力，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合緩慢或者難以愈合，給患者帶來各種傷害和不便[2-3]。開發(fā)針對(duì)此類愈合周期較長(zhǎng)的傷口護(hù)理敷料具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。

膠原作為皮膚表層細(xì)胞中重要的蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞外基質(zhì)中以纖維形式存在，尺寸在50～500 nm之間[1,4]，因此，膠原納米纖維可從組成和結(jié)構(gòu)上模擬細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)胞的黏附增殖，在外用敷料中有很大的應(yīng)用前景[1,5]。此外，納米纖維具有很高的比表面積和多孔結(jié)構(gòu)，這賦予了敷料很多優(yōu)異的性能，如對(duì)傷口輪廓更好的貼合性，良好的透氣性和透濕性，可為傷口提供合適的濕潤(rùn)環(huán)境以及充足的氧氣等[6-7]。由于膠原的三螺旋分子結(jié)構(gòu)，其分子鏈的剛度較大，因此，可和其他聚合物如聚環(huán)氧乙烷(PEO)混紡，從而大大改善膠原的紡絲性能。此外，靜電紡膠原納米纖維由于缺乏體內(nèi)合成中的交聯(lián)過程，其耐水性極差、力學(xué)強(qiáng)度低、降解速度快[8]，因此，需要對(duì)靜電紡膠原納米纖維進(jìn)行交聯(lián)處理，以提高其作為傷口敷料時(shí)在液態(tài)環(huán)境下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

膠原常用的交聯(lián)方式有物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)。物理交聯(lián)包括紫外光交聯(lián)、干熱交聯(lián)以及伽馬射線交聯(lián)等，整個(gè)交聯(lián)過程中無化學(xué)物質(zhì)引入，不會(huì)造成細(xì)胞毒性，但其交聯(lián)效率過低，交聯(lián)也不均勻[9]?；瘜W(xué)交聯(lián)是利用化學(xué)試劑對(duì)膠原進(jìn)行交聯(lián)，常用的化學(xué)試劑包括戊二醛(GA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽/N-烴基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)、京尼平等[9-11]。在這些交聯(lián)劑中，GA是最常用最有效的交聯(lián)劑，其反應(yīng)活性高，產(chǎn)物穩(wěn)定，但若不進(jìn)行適當(dāng)控制，易產(chǎn)生潛在的毒性。Akhshabi等[12]將膠原和硫酸軟骨素進(jìn)行混合靜電紡絲，然后用GA蒸汽交聯(lián)，結(jié)果表明GA交聯(lián)會(huì)抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞活性。作為零長(zhǎng)度交聯(lián)劑，EDC/NHS在交聯(lián)過程中只起到橋接作用，反應(yīng)結(jié)束后，可順利從反應(yīng)體系中撤出，因此，具有良好的生物相容性[13]。但利用EDC/NHS水溶液交聯(lián)時(shí)，由于膠原納米纖維的高比表面積及優(yōu)異的親水性能，會(huì)迅速從周圍環(huán)境中吸收大量水分，快速溶脹直至結(jié)構(gòu)破壞，因此，需要對(duì)反應(yīng)體系的溶劑進(jìn)行改善，減少溶劑本身對(duì)納米纖維結(jié)構(gòu)的破壞。

本文通過靜電紡絲技術(shù)制備了膠原基納米纖維膜，采用EDC/NHS對(duì)納米纖維膜進(jìn)行交聯(lián)改性并測(cè)試其交聯(lián)度，同時(shí)對(duì)交聯(lián)后納米纖維膜的溶脹性能、干濕態(tài)下的拉伸性能、溶血以及凝血性能進(jìn)行表征，探究了不同EDC/NHS濃度對(duì)納米纖維膜結(jié)構(gòu)和性能的影響，并與GA蒸汽交聯(lián)納米纖維膜的性能進(jìn)行對(duì)比，確定合適的交聯(lián)方案，為其在傷口敷料中的應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

膠原(Col，牛肌腱I型膠原，分子質(zhì)量為300 ku)，上海其勝生物制劑有限公司；聚氧化乙烯(PEO，分子質(zhì)量為100 ku)，美國(guó)陶氏化學(xué)公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，分析純，阿拉丁試劑(中國(guó))有限公司；無水氯化鈣(分析純)、磷酸氫二鈉(分析純)、冰乙酸(HAc, 分析純)、鹽酸(HCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；六氟異丙醇(HFIP，分析純)，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；無水乙醇(分析純)，常熟市鴻盛精細(xì)化工有限公司；戊二醛溶液(GA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%)、碳酸氫鈉、甘氨酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)、磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值為7.47)，美國(guó)Sigma公司。

1.2 試樣的制備

1.2.1 Col/PEO納米纖維膜的制備

將I型膠原與PEO粉末溶解在HFIP和HAc的混合溶液(二者體積比為1∶1)中，溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，Col和PEO的質(zhì)量比為4∶1。室溫下，將混合溶液置于磁力攪拌器上攪拌24 h后獲得均一穩(wěn)定的紡絲溶液。然后，將紡絲液吸入5 mL的注射器中，選用20號(hào)的銅針鈍針頭進(jìn)行靜電紡絲。紡絲參數(shù)為：紡絲電壓14～6 kV，推注速度1 mL/h，接收距離20 cm。紡絲8 h后獲得的Col/PEO納米纖維膜置于28 ℃的真空烘箱中干燥24 h，以去除未揮發(fā)的溶劑，置于干燥箱中備用，記為0#樣品。

1.2.2 Col/PEO納米纖維膜的交聯(lián)改性

EDC/NHS交聯(lián)改性：稱取一定量的EDC和NHS溶解在無水乙醇溶劑中，制備成交聯(lián)反應(yīng)溶液。其中，EDC和NHS的量比固定為2∶1，EDC的濃度分別為0.05、0.1和 0.15 mol/L。將Col/PEO納米纖維膜裁剪成直徑為80 mm的圓形，浸泡在配制好的交聯(lián)溶液中，密封后置于4 ℃環(huán)境下反應(yīng)18 h取出。然后，用0.1 mol/L的磷酸氫二鈉溶液浸泡2 h，以水解O-異?；逯虚g體。最后，用PBS緩沖溶液(pH值為7.4)清洗3次(每次5 min)后，將EDC/NHS交聯(lián)改性的Col/PEO納米纖維膜置于-18 ℃環(huán)境下冷凍12 h，然后冷凍干燥6 h后置于干燥箱中室溫條件下備用。3種濃度交聯(lián)的纖維膜分別記為1#、2#、3#。

GA交聯(lián)改性：取10 mL的25%的戊二醛溶液，倒入密封好的干燥器底部，將裁剪好的Col/PEO納米纖維膜(直徑為80 mm)固定在聚四氟乙烯板上，懸空置于干燥器中(距離底部高度為15 cm)，用凡士林涂抹干燥器四周進(jìn)行密封，置于室溫條件下反應(yīng)18 h；將交聯(lián)好的納米纖維膜取出，浸泡在0.2 mol/L的甘氨酸溶液中，于28 ℃的烘箱浸泡12 h以去除未反應(yīng)的戊二醛分子。隨后，將納米纖維膜用PBS緩沖溶液(pH=7.4)清洗3次(每次5 min)；最后與EDC/NHS交聯(lián)后的納米纖維膜類似，在相同條件下進(jìn)行冷凍干燥得到GA交聯(lián)改性的Col/PEO納米纖維膜，置于干燥箱中室溫條件下備用,記為4#。

1.3 試樣測(cè)試與表征

1.3.1 交聯(lián)度測(cè)試

為定量表征交聯(lián)發(fā)生的程度，本文用TNBS測(cè)試納米纖維膜的交聯(lián)度。將交聯(lián)前后的樣品裁剪，稱量確保其質(zhì)量在1.8～2.2 mg之間，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣并置于10 mL的離心管中。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的TNBS溶液稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的反應(yīng)液;稱取一定量的碳酸氫鈉固體溶解在去離子水中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的碳酸氫鈉溶液。然后在每個(gè)離心管中加入1 mL的碳酸氫鈉溶液和1 mL的TNBS反應(yīng)液，在40 ℃水浴反應(yīng)2 h。 隨后，每個(gè)離心管中加入3 mL的HCl溶液(濃度為6 mol/L)，于60 ℃水浴反應(yīng)1.5 h。最后，加入5 mL去離子水進(jìn)行稀釋，混合均勻后等體積取混合溶液置于96孔板中，利用Infinite 200 PRO型酶標(biāo)儀(德國(guó)Tecan公司)測(cè)試345 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度，并利用下式[14]計(jì)算交聯(lián)度(C)：

式中：Anc和Ac分別為交聯(lián)前后樣品在345 nm處的吸光度；mnc和mc分別為交聯(lián)前后樣品的質(zhì)量，mg。

1.3.2 納米纖維膜液態(tài)環(huán)境下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性測(cè)試

將交聯(lián)后的納米纖維膜裁剪成2 cm×2 cm規(guī)格，每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)平行樣。稱取樣品的初始質(zhì)量，隨后將其浸泡在PBS緩沖溶液(pH值為7.4)中7 d；最后取出樣品冷凍干燥后稱取質(zhì)量，計(jì)算樣品的質(zhì)量損失率的平均值。然后用TM-3000型掃描電子顯微鏡(SEM，日本Hitachi公司)對(duì)纖維的微觀形貌進(jìn)行觀察，并利用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)其直徑，獲得纖維直徑的溶脹率。

1.3.3 化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)試

采用Nicolet 6700型紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)測(cè)試交聯(lián)前后納米纖維膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，掃描范圍為4 000～600 cm-1。

1.3.4 熱穩(wěn)定性測(cè)試

采用DSC-4000型差示掃描量熱儀(DSC，美國(guó)Thermo Fisher公司)測(cè)試交聯(lián)前后納米纖維膜的熱穩(wěn)定性，測(cè)試范圍為25～200 ℃，升溫速率為10 ℃/min。

1.3.5 拉伸力學(xué)性能測(cè)試

采用XF-1A型電子強(qiáng)力儀(上海利浦應(yīng)用科學(xué)技術(shù)研究所)測(cè)試交聯(lián)前后納米纖維膜在干態(tài)和濕態(tài)環(huán)境下的拉伸力學(xué)性能。將交聯(lián)前后的納米纖維膜裁剪成5 mm×50 mm規(guī)格，并在測(cè)試前隨機(jī)取5個(gè)點(diǎn)測(cè)量其厚度，取平均值，然后進(jìn)行測(cè)試。干態(tài)環(huán)境：提前2 h將樣品置于20 ℃、相對(duì)濕度為65%的恒溫恒濕環(huán)境中。濕態(tài)環(huán)境：提前2 h將樣品浸泡在PBS緩沖溶液中，測(cè)試前將樣品表面水分吸干。測(cè)試時(shí)每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)平行樣，通過拉伸斷裂曲線獲得納米纖維膜的斷裂強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率和彈性模量，拉伸速度均為10 mm/min。

1.3.6 溶血性能測(cè)試

本文實(shí)驗(yàn)中采用的全血均采自成年新西蘭大白兔(體重約為2.5 kg)的耳朵靜脈，采用的凝血?jiǎng)?.109 mol/L的檸檬酸鹽，其與血液的體積比為1∶9。血液采集完成后立即混合均勻，冷藏，并在4 h內(nèi)結(jié)束所有血液測(cè)試。

溶血測(cè)試參考Elahi[15]的測(cè)試方法：取含有抗凝血?jiǎng)┑娜? mL，在1 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，用適量的PBS緩沖溶液清洗3次，取下層沉淀，隨后按照1∶34的體積比對(duì)其進(jìn)行稀釋，獲得紅細(xì)胞懸浮液(RBCS)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣中加入1 mL的RBCS和4 mL的PBS緩沖溶液，陰性對(duì)照為1 mL的RBCS和4 mL的PBS緩沖溶液，陽性對(duì)照為1 mL的RBCS和4 mL的去離子水。所有的樣品置于恒溫水浴鍋于37 ℃培養(yǎng)2 h后，在1 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心3 min，取等量上清液置于96孔板中，利用酶標(biāo)儀測(cè)試在540 nm波長(zhǎng)下的吸光度，并根據(jù)下式計(jì)算溶血率(Hp)：

式中：Dt為待測(cè)樣品的吸光度；Dpc和Dnc分別為陽性和陰性對(duì)照組的吸光度。

1.3.7 凝血性能測(cè)試

采用凝血指數(shù)(BI)對(duì)纖維膜的凝血性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。凝血指數(shù)測(cè)試參考Seon[16]的方法，分別測(cè)試樣品在5和10 min時(shí)的BCI值。將樣品裁剪成2 cm×2 cm規(guī)格，每組樣品取3個(gè)試樣，放置在12孔板中，將整個(gè)裝置密封放在37 ℃的水浴鍋中恒溫2 h，盡可能保證樣品在短時(shí)間的凝血測(cè)試中溫度保持在37 ℃。隨后，向每個(gè)孔的樣品上加入100 μL的抗凝全血和20 μL的0.2 mol/L的CaCl2溶液開啟再凝血機(jī)制。將整個(gè)裝置密封并放在37 ℃的水浴鍋中恒溫培養(yǎng)5和10 min，培養(yǎng)結(jié)束后加入5 mL去離子水，重新放回水浴鍋中培養(yǎng)5 min后取出。將上清液盡量取出置于離心管中，室溫下靜置15 min后，利用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)試其吸光度值，并按照下式計(jì)算凝血指數(shù)(BI)：

式中：It為待測(cè)樣品的吸光度;Iw為100 μL抗凝全血和5 mL去離子水混合后的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 Col/PEO納米纖維膜交聯(lián)度分析

為定量表征交聯(lián)程度的大小，采用TNBS作為顯色試劑測(cè)試交聯(lián)度，其在堿性條件下與氨基酸的游離氨基反應(yīng)形成中間絡(luò)合物，加入濃鹽酸后中間絡(luò)合物會(huì)水解，最終反應(yīng)物在約345 nm處有明顯的特征吸收峰，因此，膠原和TNBS反應(yīng)后的溶液在345 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度可反映膠原中游離氨基的數(shù)量。無論是GA還是EDC/NHS交聯(lián)，其交聯(lián)作用的發(fā)生都會(huì)消耗膠原分子鏈上的自由氨基，因此，默認(rèn)未交聯(lián)前的膠原為0%交聯(lián)，通過測(cè)量交聯(lián)前后納米纖維膜和TNBS反應(yīng)后溶液的吸光度，可定量表征交聯(lián)程度。

EDC/NHS和GA交聯(lián)對(duì)Col/PEO納米纖維膜交聯(lián)度的影響如圖1所示。可以看出，隨著EDC濃度的增加，納米纖維膜的交聯(lián)度逐漸增加。當(dāng)EDC的濃度從0.1 mol/L升高至0.15 mol/L時(shí)，納米纖維膜的交聯(lián)度從47.36%增加到49.63%，二者之間無顯著性差異。在EDC濃度初始增加階段，膠原分子鏈上有大量的羧基，EDC可與其快速進(jìn)行反應(yīng)，此時(shí)隨著EDC濃度的提高，交聯(lián)度迅速增加。隨著交聯(lián)的發(fā)生，膠原分子鏈上供EDC反應(yīng)的羧基結(jié)合位點(diǎn)迅速降低，繼續(xù)提高EDC的濃度，交聯(lián)度增加變的緩慢。

圖1 EDC/NHS和GA交聯(lián)Col/PEO納米纖維膜的交聯(lián)度測(cè)試結(jié)果

圖2 GA和EDC/NHS交聯(lián)膠原的交聯(lián)機(jī)制

2.2 Col/PEO納米纖維膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性分析

敷料在使用過程中不可避免地會(huì)接觸到傷口滲出液，而膠原在細(xì)胞外基質(zhì)中以50～500 nm的纖維形式存在，因此，膠原納米纖維需要通過交聯(lián)來維持其在液態(tài)環(huán)境下的納米纖維結(jié)構(gòu)，從而為傷口愈合提供適宜的微環(huán)境。為評(píng)價(jià)交聯(lián)對(duì)納米纖維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，對(duì)交聯(lián)后納米纖維在PBS緩沖溶液中浸泡后的形貌進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖3所示。

圖3 PBS浸泡前后Col/PEO納米纖維膜的形貌

由圖3(a)可知，Col/PEO紡絲液經(jīng)靜電紡絲后可獲得均勻連續(xù)的納米纖維，但納米纖維膜穩(wěn)定性極差，在PBS緩沖溶液中浸泡30 min后即破碎成小塊，其納米纖維結(jié)構(gòu)已經(jīng)遭到極大的破壞，因此，交聯(lián)處理對(duì)Col/PEO納米纖維膜極其重要。從圖3(b)～(e)可以看出，EDC/NHS交聯(lián)對(duì)Col/PEO納米纖維的形貌影響較小，而GA交聯(lián)獲得的納米纖維膜在未浸泡之前，纖維之間有一定的溶脹和粘連，這是由于在GA交聯(lián)過程中伴隨著水的蒸發(fā)，納米纖維膜會(huì)吸收一定的水分而溶脹，在纖維重疊地方產(chǎn)生粘連。

圖3中右側(cè)為Col/PEO納米纖維膜經(jīng)PBS浸泡后的形貌，其中，未交聯(lián)納米纖維膜的浸泡時(shí)間為30 min，交聯(lián)后納米纖維膜的浸泡時(shí)間為7 d?？梢钥闯觯?jīng)交聯(lián)后的納米纖維膜在浸泡7 d后均保留了部分納米纖維結(jié)構(gòu)，這進(jìn)一步說明交聯(lián)對(duì)液態(tài)環(huán)境下納米纖維的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提高明顯。對(duì)于EDC/NHS交聯(lián)來講，隨著EDC濃度的增加，浸泡后纖維的溶脹程度降低。其中，0.1和0.15 mol/L交聯(lián)后的2#和3#樣品在浸泡7 d后可保持良好的納米纖維結(jié)構(gòu)，其纖維直徑的溶脹率分別為183%和141%。此外，為定量表征纖維膜的耐水性，測(cè)定了交聯(lián)樣品的質(zhì)量損失率，浸泡7 d后1#～3#納米纖維膜的質(zhì)量損失率分別為(29.9±5.2)%、(33.8±2.7)%和(41.2±3.7)%，說明隨著EDC濃度的增加，纖維膜的質(zhì)量損失率逐漸降低。

2.3 Col/PEO納米纖維膜化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

未交聯(lián)、 EDC/NHS(EDC濃度為0.1 mol/L)以及GA交聯(lián)的Col/PEO納米纖維膜的紅外光譜圖如圖4所示。

圖4 交聯(lián)前后Col/PEO納米纖維膜的紅外光譜圖

2.4 Col/PEO納米纖維膜熱穩(wěn)定性分析

膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)隨著溫度的升高逐漸解開，最終變成3條無規(guī)則的肽鏈，造成其生物功能的急劇下降，因此，可利用DSC測(cè)試交聯(lián)處理后Col/PEO納米纖維膜的熱穩(wěn)定性。在膠原加熱過程中會(huì)產(chǎn)生1個(gè)典型的熱吸收峰，其峰值溫度稱為變性溫度[18]。交聯(lián)前后納米纖維膜以及膠原的DSC升溫特征曲線及變性溫度如圖5所示。可以看出，純膠原的DSC曲線上有1個(gè)寬的特征吸收峰，而交聯(lián)后的納米纖維膜均出現(xiàn)了2個(gè)特征吸收峰，其中，51 ℃附近較弱的吸熱峰是由于納米纖維膜中一定量PEO的存在造成的。同時(shí)，第2個(gè)寬的特征吸收峰可表征膠原的熱穩(wěn)定性，膠原經(jīng)過靜電紡絲后，其變性溫度降低了約10.8 ℃，這和靜電紡絲的加工方式有關(guān)。有研究表明，靜電紡絲加工方式會(huì)造成聚合物分子鏈的鏈節(jié)運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，從而造成其變性溫度降低[19]。

圖5 膠原以及交聯(lián)前后Col/PEO納米纖維膜的DSC升溫曲線

與未交聯(lián)的Col/PEO納米纖維膜(0#)相比，交聯(lián)后Col/PEO納米纖維膜的變性溫度都有了不同程度的提高，其中GA交聯(lián)纖維膜(4#)的變性溫度升高近9.5 ℃，而采用EDC/NHS交聯(lián)，當(dāng)EDC濃度為0.1 mol/L時(shí)，交聯(lián)納米纖維膜(2#)的變性溫度略高于未交聯(lián)的納米纖維膜。綜合以上分析可以看出，GA交聯(lián)處理提高了膠原的熱穩(wěn)定性，而EDC/NHS交聯(lián)對(duì)于膠原的熱穩(wěn)定性無明顯影響。不同交聯(lián)方式對(duì)膠原熱穩(wěn)定提高的差異，可能是由于GA交聯(lián)在交聯(lián)位點(diǎn)上的交聯(lián)間距大于EDC交聯(lián)的，導(dǎo)致GA交聯(lián)纖維膜中膠原產(chǎn)生較多的分子間交聯(lián)，而EDC交聯(lián)產(chǎn)生的分子間交聯(lián)較少的緣故[20]。

2.5 Col/PEO納米纖維膜力學(xué)性能分析

無論傷口敷料是外用保護(hù)皮膚傷口，還是作為內(nèi)部傷口支撐，在使用過程中都需要承受一定的張力。交聯(lián)前后Col/PEO納米纖維膜的拉伸曲線如圖6所示。從圖6(a)可以看出：交聯(lián)前后納米纖維膜在干態(tài)環(huán)境下的應(yīng)力-應(yīng)變曲線相似，在拉伸的初始階段，納米纖維膜中的納米纖維先伸直，表現(xiàn)為隨著外力的增加，納米纖維膜的應(yīng)力應(yīng)變均顯著增加；當(dāng)納米纖維膜中的纖維完全伸直后，外力繼續(xù)增加，纖維之間會(huì)產(chǎn)生相互滑移，表現(xiàn)為隨著外力的增加，納米纖維膜的應(yīng)變逐漸增加，但應(yīng)力變化很??；最后隨著拉伸的繼續(xù)，纖維的滑移逐漸減小，在拉伸作用下斷裂，表現(xiàn)為隨著外力的增加，納米纖維膜的應(yīng)變繼續(xù)增加，但應(yīng)力急劇下降。

圖6 交聯(lián)前后Col/PEO納米纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線

從圖6(b)可以看出，在濕態(tài)環(huán)境下，交聯(lián)后Col/PEO納米纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線沒有出現(xiàn)明顯的屈服階段，這可能是由于納米纖維在濕態(tài)環(huán)境下吸水溶脹并產(chǎn)生一定的粘連，在拉伸作用下纖維之間的滑移阻力比較大，因此，應(yīng)力隨著應(yīng)變的增加而逐漸變大。

表1示出交聯(lián)后Col/PEO納米纖維膜在干態(tài)和濕態(tài)環(huán)境下拉伸性能測(cè)試結(jié)果。未交聯(lián)的樣品在干態(tài)環(huán)境下的斷裂強(qiáng)度為(2.18±0.43) MPa，斷裂伸長(zhǎng)率為(79.77±6.43)%。由表1可以看出，相對(duì)于未交聯(lián)納米纖維膜，交聯(lián)會(huì)使其斷裂強(qiáng)度增加，而斷裂伸長(zhǎng)率降低，這是由于交聯(lián)作用增加了膠原分子間的作用力，降低了纖維膜的厚度，纖維膜斷裂強(qiáng)度隨之增加；此外，分子間作用力的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致纖維之間產(chǎn)生滑移阻力，使斷裂伸長(zhǎng)率出現(xiàn)降低。此外，EDC/NHS交聯(lián)中，當(dāng)EDC濃度為0.1和0.15 mol/L時(shí)，交聯(lián)后獲得的Col/PEO納米纖維膜(2#和3#)的力學(xué)性能指標(biāo)無顯著性差異?？梢钥闯?，相對(duì)于干態(tài)環(huán)境，濕態(tài)環(huán)境下納米纖維膜的斷裂強(qiáng)度顯著降低(P<0.01)，斷裂伸長(zhǎng)率顯著提高(P<0.01)。斷裂強(qiáng)度的降低是由于經(jīng)過PBS浸泡后，水分子進(jìn)入纖維內(nèi)部，纖維膨脹造成其一定程度的解取向。此外，經(jīng)過靜電紡絲后納米纖維并不是以最低能量的狀態(tài)沉積在接收裝置上，因此，浸泡后的納米纖維會(huì)調(diào)整到最低能量狀態(tài)，產(chǎn)生一定程度的卷曲，同時(shí)纖維集合體中水分的存在也會(huì)降低纖維之間的滑移阻力，最終使纖維膜斷裂伸長(zhǎng)率增加[21-22]。

表1 交聯(lián)后Col/PEO納米纖維膜的力學(xué)性能

2.6 Col/PEO納米纖維膜溶血性能分析

在傷口敷料的使用過程中，其會(huì)和血液中紅細(xì)胞、血小板等直接接觸，因此，血液相容性對(duì)傷口敷料的應(yīng)用至關(guān)重要。溶血現(xiàn)象是指血液中的紅細(xì)胞與生物材料接觸時(shí)，紅細(xì)胞破裂釋放血紅蛋白的現(xiàn)象，通過監(jiān)測(cè)上清液的吸光度，可表征樣品對(duì)紅細(xì)胞的破壞程度。為直觀檢驗(yàn)交聯(lián)處理后納米纖維膜是否會(huì)破壞紅細(xì)胞，溶血率檢測(cè)后離心提取上清液觀察，上清液的顏色越紅，說明破壞的紅細(xì)胞數(shù)量越多。溶血率測(cè)試后溶液的上清液外觀圖如圖7(a)所示?？梢钥闯觯栃詫?duì)照樣以外，所有交聯(lián)Col/PEO納米纖維膜的上清液均呈現(xiàn)出和陰性對(duì)照樣一樣接近透明的顏色。

圖7 Col/PEO納米纖維膜溶血測(cè)試上清液外觀圖及溶血率測(cè)試結(jié)果

為定量表征Col/PEO納米纖維膜的溶血率，通過對(duì)上清液的吸光度進(jìn)行測(cè)試，計(jì)算纖維膜的溶血率結(jié)果如圖7(b)所示?？梢钥闯觯薪宦?lián)后的Col/PEO納米纖維膜的溶血率均在0.1%～0.3%之間。參考ASTM F756—2017《材料溶血性能評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施規(guī)程》可知，經(jīng)過交聯(lián)后納米纖維膜均不溶血，這說明交聯(lián)處理后的Col/PEO納米纖維膜具有良好的血液相容性。

2.7 Col/PEO納米纖維膜凝血性能分析

關(guān)于材料的凝血性能，有研究證明在無輔助方式的情況下，一般傷口均可在自身凝血系統(tǒng)的幫助下在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)凝血[16]，因此，為在體外表征納米纖維膜的止血效果，測(cè)試了所有交聯(lián)樣品在5和10 min時(shí)的凝血指數(shù)(BI)，結(jié)果如圖8所示。

圖8 交聯(lián)前后Col/PEO納米纖維膜及醫(yī)用紗布的凝血指數(shù)

由圖8可以看出，所有樣品在10 min時(shí)的BI值均顯著低于5 min時(shí)的(P<0.01)，這是由于隨著凝血時(shí)間的延長(zhǎng)，血液中的凝血塊會(huì)越來越穩(wěn)固，當(dāng)加入去離子水時(shí)，破裂的紅細(xì)胞會(huì)越來越少，BI值就越低。在相同的時(shí)間點(diǎn)，Col/PEO納米纖維膜的BI值均顯著低于醫(yī)用紗布(圖中5#)的(P<0.001)，這表明Col/PEO納米纖維膜在無外力幫助下，會(huì)顯著促進(jìn)血液凝固。此外，和未交聯(lián)的Col/PEO納米纖維膜相比，交聯(lián)Col/PEO納米纖維膜的BI值均顯著降低(P<0.05)，這表明交聯(lián)處理可提高其凝血性能，但不同交聯(lián)方式以及不同EDC/NHS濃度的交聯(lián)樣品之間無顯著差異。

眾所周知，膠原可促進(jìn)血小板的黏附和聚集，從而促進(jìn)凝血過程的發(fā)生[23-24]，因此，對(duì)于Col/PEO納米纖維膜來講，其應(yīng)該能夠?yàn)檠“宓酿じ胶途奂峁┳銐蚍€(wěn)定的物理支持，以促進(jìn)血小板黏附和凝血因子的結(jié)合，并最終迅速形成血凝塊[23-24]。對(duì)于未交聯(lián)的樣品，納米纖維接觸到血液時(shí)會(huì)快速吸收水分并溶脹，纖維膜結(jié)構(gòu)的完整性將被部分破壞，無法為凝血因子的黏附以及凝血塊的形成提供有效的物理支持，因此，交聯(lián)樣品的BI值會(huì)顯著低于未交聯(lián)的樣品。

3 結(jié) 論

本文采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)為交聯(lián)劑，對(duì)膠原/聚環(huán)氧乙烷(Col/PEO)納米纖維進(jìn)行交聯(lián)。首先，探究了不同濃度EDC交聯(lián)18 h后納米纖維膜的交聯(lián)度變化。結(jié)果表明，隨著EDC濃度的增加，納米纖維膜的交聯(lián)度逐漸增加，0.1和0.15 mol/L交聯(lián)Col/PEO納米纖維的交聯(lián)度之間無顯著性差異。其次，對(duì)交聯(lián)后納米纖維膜在液態(tài)環(huán)境下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、力學(xué)性能和理化性能進(jìn)行表征。結(jié)果表明，經(jīng)交聯(lián)后Col/PEO納米纖維在液態(tài)環(huán)境下的溶脹明顯降低，在PBS緩沖溶液中浸泡7 d后仍可保持比較好的納米纖維形貌，力學(xué)性能也顯著增加。最后，對(duì)交聯(lián)Col/PEO納米纖維的血液相容性進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，交聯(lián)后的納米纖維對(duì)紅細(xì)胞沒有明顯破壞，在體外可明顯促進(jìn)血液凝固。上述結(jié)果表明，Col/PEO納米纖維膜經(jīng)過EDC/NHS交聯(lián)后，其在愈合周期長(zhǎng)、愈合速度較慢的傷口護(hù)理中具備很大的應(yīng)用潛力。