胡廷棟，王 蒙，劉曉蕊，楊海元，戴一凡，王 盈

江蘇省異種移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，江蘇 南京 211166

肽基脯氨酰順/反異構(gòu)酶NIMA互作蛋白1（peptidyl-prolyl cis/trans isomerases，NIMA-interacting1，PIN1）能特異性識(shí)別磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸-脯氨酸（pSer/Thr-Pro）基序并與其結(jié)合，通過催化磷酸化底物的順反異構(gòu)來調(diào)節(jié)酶的活性、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或目的蛋白的亞細(xì)胞定位。PIN1的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，其表達(dá)失調(diào)在許多病理狀態(tài)下發(fā)揮著重要的作用，尤其是癌癥及多種神經(jīng)退行性疾病。在大多數(shù)癌癥中PIN1呈高度表達(dá)狀態(tài)并促進(jìn)了癌癥的發(fā)展，在多數(shù)神經(jīng)退行性疾病中，PIN1表達(dá)卻被下調(diào)［1］。據(jù)報(bào)道，PIN1激活超過50種癌癥信號(hào)通路，并下調(diào)超過20種腫瘤抑制因子及生長抑制因子［2］。在神經(jīng)元中，PIN1可抑制神經(jīng)纖維纏結(jié)和β-淀粉樣蛋白斑塊的形成，從而阻止阿爾茲海默癥的發(fā)生［3］。在神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育后期，PIN1通過抑制β-catenin的降解，調(diào)控成體神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）的分化［4］。而在氧化應(yīng)激或谷氨酸興奮性毒性中，抑制PIN1的表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活［5］。這些結(jié)果表明PIN1在與氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著重要的作用。

NSC具有高度的自我更新能力、多向分化潛能和遷移能力，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷，如神經(jīng)退行性疾病、缺血缺氧損傷時(shí)，NSC可以增殖、遷移、分化為新生神經(jīng)細(xì)胞，以代償結(jié)構(gòu)和功能損傷［6］。因此在NSC的體外培養(yǎng)條件下，對(duì)其分子調(diào)節(jié)機(jī)制、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型及神經(jīng)組織工程的研究具有重要的價(jià)值［7］。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由于載體構(gòu)建簡單、靶向位點(diǎn)選擇靈活等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于各類細(xì)胞的基因編輯，通過CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)NSC特定基因進(jìn)行編輯，可在體外揭示相關(guān)基因?qū)SC的影響及其功能，并為基因分析提供重要的依據(jù)。但目前針對(duì)成體NSC的靶向基因編輯鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)成體NSC的PIN1基因進(jìn)行敲除，測定基因敲除效率及蛋白表達(dá)水平，并對(duì)PIN1敲除NSC特征性標(biāo)志物巢蛋白（Nestin）的表達(dá)、分化能力進(jìn)行了初步研究，為后續(xù)利用條件敲除的小鼠模型研究PIN1基因在成體神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

8周齡C57BL/6小鼠，由南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS（Gibco公司，美國）；葡萄糖、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）、Accutase、HEPES Buffer、Progesterone、Putrescine、Heparin、二甲基亞砜、多聚賴氨酸（Sigma公司，美國）；B-27 Growth Supplement、胰島素鐵硒傳遞蛋白（ITSS）、胰酶（Invitrogen公司，美國）；層黏連蛋白（Roche公司，德國）；PX330（Addgene公司，美國）；DH5α感受態(tài)、質(zhì)粒中提試劑盒（北京天根生化科技公司）；DNA Marker DL2000、pMD18-T載體（TaKaRa公司，日本）；膠回收試劑盒（Qiagen公司，德國）；BbsⅠ限制性內(nèi)切酶（New England Biolabs公司，美國）；Basic NucleofectorTMkit和細(xì)胞電轉(zhuǎn)儀（Lonza公司，德國）；Mix Taq酶（南京諾唯贊公司）；Mouse anti-Nestin（BD Biosciences公司，美國）；Chicken anti-Beta ⅢTubulin（Chemicon公司，德國）；Goat anti-Chicken IgY Alexa Fluor 488（Sigma公司，美國）；Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594、Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488（Abcam公司，英國）；Rabbit anti-PIN1、Mouse anti-β-actin（Proteintech公司，美國）；DAPI（Tedia公司，美國）；SurePAGETM預(yù)制膠（南京金斯瑞公司）。

1.2 方法

1.2.1 NSC的體外分離、培養(yǎng)

根據(jù)張正衛(wèi)［8］體外培養(yǎng)NSC的方法予以改進(jìn)，取8周小鼠斷頭處死，用75%酒精消毒后，在無菌條件下取出大腦。將大腦置于預(yù)冷的PBS中進(jìn)行縱切，并于顯微鏡下分離側(cè)腦室下區(qū)外兩側(cè)壁。將分離的組織放置于預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基中，用剪刀充分剪碎后，離心350g5 min，取出上清，加入0.05%胰酶于37 ℃培養(yǎng)箱中消化成單個(gè)細(xì)胞，加入胰酶終止劑終止消化后離心350g5 min，取出上清，加入NSC無血清培養(yǎng)基（DMEM/F12、6 mg/mL葡萄糖、5 mmol/L HEPES Buffer、2 μmol/L Progesterone、0.6 μmol/L Putrescine、1×B-27 Growth Supplement、0.02 μg/mL EGF、0.005 μg/mL bFGF、10 μg/mL ITSS、1.8 μg/mL Heparin），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 NSC的傳代與培養(yǎng)

原代NSC于無血清培養(yǎng)基中每2～3 d進(jìn)行半量換液，7 d左右可形成神經(jīng)球。吸取原代神經(jīng)球于離心管中，離心300g5 min，取出上清，加入500 μL Accutase，輕柔吹打后置于37 ℃熱臺(tái)消化3 min，離心500g5 min，取出上清后加入500 μL無血清培養(yǎng)基吹打至單個(gè)細(xì)胞。將單細(xì)胞懸液置于12孔板中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。此后每2～3 d進(jìn)行半量換液，5 d左右進(jìn)行傳代。

NSC單層貼壁培養(yǎng)：將包被液（200 μg/mL多聚賴氨酸、0.25 μg/mL層黏連蛋白）加入至12孔板，于37 ℃培養(yǎng)箱中包被過夜，次日超凈臺(tái)中去除包被液，干燥30 min，PBS清洗3遍。將NSC單細(xì)胞懸液以5×105個(gè)/mL的密度接種于包被的孔板中，約2 h NSC貼壁。此后每2～3 d進(jìn)行半量換液，約5 d NSC可長滿培養(yǎng)皿，對(duì)其進(jìn)行傳代。

1.2.3 sgRNA的設(shè)計(jì)與CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小鼠PIN1（Gene ID：23988）的基因序列，使用sgRNA在線設(shè)計(jì)軟件（https：//zlab.bio/guide-design-resources），針對(duì)PIN1的第2個(gè)外顯子設(shè)計(jì)sgRNA，PIN1-sgRNA-F：5′-CACCGAGCCAGTGGGAGCGGCCCAG -3′，PIN1 -sgRNA-R：5′-AAACCTGGGCCGCTCCCACTGGCTC-3′，進(jìn)行5′端磷酸化修飾，并在兩端加上可與BbsⅠ酶切位點(diǎn)相連接的黏性末端（由南京金斯瑞生物公司合成）。

經(jīng)引物退火、BbsⅠ酶切PX330載體使其線性化，線性化的PX330載體與sgRNA連接構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，然后將載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α中，涂布于LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃過夜。次日挑取單克隆菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及單克隆細(xì)胞的獲得及鑒定

取成球狀態(tài)的NSC，傳代分散成單細(xì)胞懸液，加入無血清培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。按照Lonza轉(zhuǎn)染試劑盒說明書配制核轉(zhuǎn)液，后加入2 μg PIN1-Cas9-sgRNA及2 μg的PGK/puro抗性質(zhì)粒。調(diào)整細(xì)胞量至2×106個(gè)，加至核轉(zhuǎn)液中重懸。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯，放入Lonza核轉(zhuǎn)儀杯槽內(nèi)，選擇T-030程序進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至2 mL的無血清培養(yǎng)基中，輕輕吹打分散均勻后，轉(zhuǎn)移至6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后用含有0.6 μg/mL Puro的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每2 d進(jìn)行半數(shù)換液，約5 d后，可獲得單細(xì)胞克隆的神經(jīng)球，利用吸卵針在顯微鏡下隨機(jī)吸取神經(jīng)球至96孔板中進(jìn)行傳代。待傳代至12孔板后，挑取3/4細(xì)胞凍存，1/4細(xì)胞用NP40裂解提基因組，進(jìn)行TA克隆鑒定細(xì)胞基因型。將提取的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃5 min，變性95 ℃30 s；退火56 ℃30 s，延伸72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；總延伸72 ℃7 min，4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，用膠回收試劑盒提取膠回收產(chǎn)物，再與pMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α中，涂菌，挑取單克隆菌落進(jìn)行測序。將野生型序列與測序結(jié)果對(duì)比得到敲除基因型。

1.2.5 Western blot驗(yàn)證敲除效果

分別提取PIN1敲除NSC和野生型NSC的蛋白，加熱變性后，等量上樣，采用120 V電壓進(jìn)行電泳，使待檢測蛋白進(jìn)入最佳分辨區(qū)。將轉(zhuǎn)膜槽置于冰中，采用濕轉(zhuǎn)法，經(jīng)250 mA、90 min將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h后，孵育一抗Rabbit anti-PIN1（1∶1 000），4 ℃搖床過夜，次日取出，PBST清洗3遍，加入二抗（1∶5 000），室溫?fù)u床孵育1 h后PBST清洗3遍，加入ECL結(jié)合1 min，暗室曝光。

1.2.6 PIN1敲除NSC PIN1的免疫熒光染色

將PIN1敲除NSC和野生型NSC進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)，待NSC貼壁完全后，去除培養(yǎng)基，預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3遍，加入0.5%的Triton X-100通透5 min后，PBS清洗3遍，10%山羊血清室溫封閉1 h，加入一抗Rabbit anti-PIN1（1∶500），4 ℃搖床過夜，PBST清洗3遍，加入Alexa Fluor 594標(biāo)記二抗（1∶200），室溫?fù)u床避光孵育1 h，PBST清洗3遍，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.7 PIN1敲除NSC Nestin的免疫熒光染色

將PIN1敲除的NSC進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)，待NSC貼壁完全后，去除培養(yǎng)基，預(yù)冷的4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3遍，加入0.5%的Triton X-100通透5 min后，PBS清洗3遍，10%山羊血清室溫封閉1 h，加入一抗Mouse anti-Nestin（1∶500），4 ℃搖床過夜，PBST清洗3遍，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記二抗（1∶200），室溫?fù)u床避光孵育1 h，PBST清洗3遍，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.8 PIN1敲除NSC的定向分化測定

將PIN1敲除的NSC進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)，并將培養(yǎng)基換為神經(jīng)元誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（在無血清培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，去掉EGF，bFGF濃度降低一半，加入1 μmol/L視黃酸和1%FBS）繼續(xù)培養(yǎng)，約10 d后吸除培養(yǎng)基，加入0.2%的Triton X-100通透5 min后，PBS清洗3遍，10%山羊血清室溫封閉1 h，加入一抗Chicken anti-Beta ⅢTubulin（1∶500），4 ℃搖床過夜，PBS清洗3遍，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記二抗（1∶200），室溫?fù)u床避光孵育1 h，PBST清洗3遍，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 NSC體外培養(yǎng)形態(tài)

8周齡小鼠大腦縱切，分離側(cè)腦室下區(qū)外兩側(cè)壁，剪碎消化后于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7 d左右大多數(shù)組織細(xì)胞死亡，NSC可存活并分裂成團(tuán)形成NSC球（圖1A）。在無血清培養(yǎng)基中，NSC呈懸浮狀態(tài)；在多聚賴氨酸和層黏連蛋白處理的培養(yǎng)皿中，NSC變?yōu)閱螌淤N壁細(xì)胞（圖1B）。

2.2 CRISPR/Cas9敲除位點(diǎn)選擇和打把載體構(gòu)建

使用sgRNA在線設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)PIN1的第2個(gè)外顯子設(shè)計(jì)sgRNA（圖2A）。將sgRNA與PX330載體質(zhì)粒連接后，進(jìn)行測序，結(jié)果顯示sgRNA與PX330成功連接（圖2B）。

2.3 PIN1基因敲除NSC克隆的獲得與鑒定

Puro篩選5 d后，隨機(jī)挑選了16個(gè)單細(xì)胞克隆，選取其中9個(gè)狀態(tài)好的單細(xì)胞克隆進(jìn)行凍存，經(jīng)過基因型鑒定，9個(gè)細(xì)胞克隆均發(fā)生基因突變（表1）。

2.4 PIN1的免疫熒光染色和Western blot驗(yàn)證敲除效果

PIN1的免疫熒光染色（圖3A）及Western blot（圖3B）分析PIN1蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示野生型NSC PIN1蛋白正常表達(dá)，而PIN1敲除NSC的PIN1蛋白無表達(dá)。表明CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可有效敲除NSC PIN1基因，使蛋白無法表達(dá)。

2.5 PIN1敲除NSC Nestin表達(dá)情況

圖1 8周齡小鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)形態(tài)（×100）Figure 1 Morphology of cultured adult neural stem cells from 8-weeks old mice（×100）

PIN1敲除NSC單層貼壁培養(yǎng)后進(jìn)行Nestin免疫熒光染色，結(jié)果顯示，PIN1基因敲除后的NSC仍為Nestin陽性（圖4），表明PIN1基因敲除后的NSC仍然表達(dá)Nestin。

2.6 PIN1敲除NSC分化情況

在分化培養(yǎng)基中添加視黃酸可誘導(dǎo)NSC向神經(jīng)細(xì)胞定向分化［9］，當(dāng)單層貼壁培養(yǎng)的PIN1敲除NSC在定向分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，可觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，大約3 d時(shí)，細(xì)胞生成突起，并形成網(wǎng)絡(luò)，連接各個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞培養(yǎng)2周時(shí)，進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，分化后的細(xì)胞大部分呈現(xiàn)BetaⅢTubulin（神經(jīng)元）陽性（圖5），表明PIN1敲除后的NSC仍具有分化的能力。

圖2 CRISPR/Cas9敲除位點(diǎn)選擇和打把載體構(gòu)建Figure 2 CRISPR/Cas9 knockout site selection and construction of vector

表1 PIN1-/-神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞克隆基因型Table 1 Genotypes of neural stem cell PIN1-/-colonies

圖3 免疫熒光染色及Western blot分析WT及PIN1敲除神經(jīng)干細(xì)胞PIN1蛋白表達(dá)變化Figure 3 Immunofluorescence and Western blot analysis of PIN1 protein expression in WT and PIN1 knockout neural stem cells

圖4 免疫熒光染色顯示神經(jīng)干細(xì)胞為Nestin陽性（×100）Figure 4 Neural stem cells are nestin positive revealed by immunofluorescence（×100）

圖5 免疫熒光染色顯示神經(jīng)干細(xì)胞可分化為神經(jīng)元（×200）Figure 5 Neural stem cells could differentiate into neurons revealed by immunofluorescence（×200）

3 討論

成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)成體神經(jīng)干細(xì)胞的存在，改變了人們長期以來認(rèn)為神經(jīng)不可再生的觀點(diǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新、無限增殖和多向分化的能力，通過體外培養(yǎng)，為研究神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化等提供了有效手段，并為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷如神經(jīng)退行性疾病、缺血缺氧損傷提供了新的思路和途徑。本實(shí)驗(yàn)從8周齡的小鼠腦室下區(qū)中提取神經(jīng)干細(xì)胞，采用無血清培養(yǎng)基，通過懸浮培養(yǎng)及貼壁單層培養(yǎng)，進(jìn)行傳代、增殖。通過對(duì)多個(gè)代次神經(jīng)干細(xì)胞的分析，采用的培養(yǎng)方法可有效維持神經(jīng)干細(xì)胞的特性。PIN1在多種類型的細(xì)胞中發(fā)揮著重要的作用，在細(xì)胞的增殖、分化及存活等多種生物學(xué)過程中產(chǎn)生影響。PIN1不僅可作為分子開關(guān)，通過介導(dǎo)構(gòu)象的改變，使得特定的蛋白激活或失活［1-3］；還可在細(xì)胞的不同階段調(diào)節(jié)多個(gè)靶點(diǎn)，對(duì)多個(gè)目的蛋白的構(gòu)象及功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，協(xié)同控制反應(yīng)強(qiáng)度及時(shí)間，起到分子計(jì)時(shí)器的作用［10］。在神經(jīng)系統(tǒng)中，PIN1的表達(dá)不僅與細(xì)胞的增殖相關(guān)，還與神經(jīng)干細(xì)胞的分化、神經(jīng)元的功能有密切關(guān)系［11-13］。而現(xiàn)在針對(duì)NSC的靶向基因編輯鮮有報(bào)道，因此，建立PIN1基因敲除成體神經(jīng)干細(xì)胞系對(duì)研究PIN1在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用具有重要意義。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為基因編輯創(chuàng)造了前所未有的發(fā)展機(jī)遇，由于其快速有效且相對(duì)容易對(duì)特定基因進(jìn)行編輯，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于生物、基因治療等領(lǐng)域。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在神經(jīng)干細(xì)胞中進(jìn)行精確的基因編輯，將為干細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域提供重要的思路和機(jī)會(huì)。在本實(shí)驗(yàn)中，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞中PIN1基因進(jìn)行敲除。測序結(jié)果顯示，在設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)位置會(huì)出現(xiàn)不同形式的堿基缺失和插入突變，隨機(jī)挑選并進(jìn)行測序的單克隆神經(jīng)干細(xì)胞PIN1基因均發(fā)生了突變，說明CRISPR/Cas9技術(shù)在神經(jīng)干細(xì)胞基因編輯中的高效性。利用免疫熒光染色和Western blot對(duì)PIN1蛋白的表達(dá)進(jìn)行測定，結(jié)果表明，在野生型神經(jīng)干細(xì)胞中，PIN1蛋白正常表達(dá)，而PIN1基因敲除后蛋白無表達(dá)，說明CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有效地敲除了神經(jīng)干細(xì)胞中PIN1基因，并抑制了其蛋白的表達(dá)。

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在成體神經(jīng)干細(xì)胞中特異性敲除目的基因，通過基因測序、免疫熒光染色及Western blot證實(shí)了其高效性和有效性。但經(jīng)過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除PIN1基因后的神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)有什么樣的表型變化尚未可知。神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定可通過特征性標(biāo)志物Nestin及分化潛能進(jìn)行。Nestin具有一般中間絲特征，又被稱為神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白，其分布在神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈一過性表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生遷移、分化后，Nestin便停止表達(dá)，因此其可作為未分化神經(jīng)干細(xì)胞的抗原標(biāo)志，用于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定［14］。通過免疫熒光染色鑒定結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞仍然表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特征性標(biāo)志物Nestin。神經(jīng)干細(xì)胞具有分化潛能，當(dāng)從神經(jīng)干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基中去除生長因子后，體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞逐漸開始分化，并由懸浮狀態(tài)變?yōu)橘N壁生長，經(jīng)過10 d左右，可分化為3類神經(jīng)細(xì)胞：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。分化后的神經(jīng)細(xì)胞折光性較強(qiáng)，分出許多突起，連接各個(gè)細(xì)胞形成網(wǎng)絡(luò)，并存在趨向生長的特點(diǎn)［15］。神經(jīng)元常用的特異性抗原標(biāo)志物有NeuN、Beta ⅢTubulin及微管相關(guān)蛋白等，其中Beta ⅢTubulin為神經(jīng)元及部分腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的微管蛋白，而非神經(jīng)元的其他神經(jīng)細(xì)胞均不表達(dá)，其主要表達(dá)在新生神經(jīng)元中，遍布于整個(gè)突起，因此可用于神經(jīng)元鑒定的特異性標(biāo)志物。PIN1敲除的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化后，雖然仍可表達(dá)神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物Beta ⅢTubulin，但其往神經(jīng)元方向分化的能力較正常細(xì)胞是否有變化，依然需要更多實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證，以及向星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化能力也有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)NSC PIN1基因的敲除及特異性標(biāo)志物Nestin及分化潛能的測定，為我們后續(xù)利用條件敲除的小鼠模型研究PIN1基因在成體神經(jīng)發(fā)生中的作用以及參與阿爾茲海默病的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9技術(shù)在神經(jīng)干細(xì)胞基因編輯具有巨大的潛力，本研究表明，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，可以在神經(jīng)干細(xì)胞中進(jìn)行有針對(duì)性、精確且高效的基因編輯。通過挑選單克隆細(xì)胞，可保證細(xì)胞基因型的單一穩(wěn)定，為針對(duì)機(jī)制方面的體外研究提供很好的工具，CRISPR/Cas9技術(shù)在神經(jīng)干細(xì)胞基因編輯方面具有非常大的可行性和良好的應(yīng)用前景。