侍崇龍，董洪權(quán)，金文杰

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210029

近年來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病的發(fā)病率迅速增加，給全球帶來嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。中樞炎癥被認(rèn)為廣泛參與了CNS疾病的發(fā)生發(fā)展，并被列為一項(xiàng)重要的危險(xiǎn)因素［2］。腦內(nèi)免疫細(xì)胞感受到外界刺激后可產(chǎn)生過量的炎癥因子，作用于神經(jīng)元引起神經(jīng)系統(tǒng)功能下降［3］。因此，探究中樞炎癥的潛在機(jī)制對(duì)于CNS退行性疾病的治療具有深遠(yuǎn)意義。

海馬是CNS中負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，情景恐懼事件的學(xué)習(xí)和記憶過程均依賴于海馬。海馬中分布著大量的小膠質(zhì)細(xì)胞（microglial cell，MG）。MG活化后產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子促進(jìn)了中樞炎癥的發(fā)生發(fā)展［4］。MG在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮支持、保護(hù)、修復(fù)和營養(yǎng)等作用［5］，正常生理?xiàng)l件下，MG呈分枝狀，處于靜息狀態(tài)。在應(yīng)激情況下，MG可被迅速激活，表現(xiàn)為M1和M2兩種表型。其中，M1型主要產(chǎn)生促炎介質(zhì)最終導(dǎo)致組織損傷；相反，M2型釋放抗炎介質(zhì)最終幫助損傷組織修復(fù)［6］。因此抑制和調(diào)控MG的過度激活可能為治療與海馬相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供新的靶點(diǎn)。

組氨酸經(jīng)組氨酸脫羧酶（histidine decarboxylase，HDC）脫羧基生成組胺（histamine）。α-FMH即HDC抑制劑，是一種有效的、特異的和不可逆的腦組胺活性抑制劑。據(jù)報(bào)道，α-FMH全身給藥后會(huì)顯著降低胃組胺的含量，且與胃組胺相比，大腦中組胺活性下降會(huì)發(fā)生延遲。因此目前常用的有效耗竭腦組胺的方法為通過HDC基因敲除或腦室內(nèi)注射α-FMH。CNS中的組胺主要由肥大細(xì)胞及MG產(chǎn)生［7］。組胺作為CNS中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛參與神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、體溫調(diào)節(jié)、睡眠與覺醒、學(xué)習(xí)與記憶等功能活動(dòng)［8］。此外，組胺也參與CNS疾病的進(jìn)展，如帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化癥等［9-10］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，MG可以表達(dá)4種組胺受體（H1R、H2R、H3R和H4R），組胺能選擇性地上調(diào)原代培養(yǎng)的MG中H1R和H4R的表達(dá)，且呈劑量依賴性［11］。由于MG在神經(jīng)炎癥病理生物學(xué)中的關(guān)鍵作用，確定組胺對(duì)MG的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制意義深遠(yuǎn)。

本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)報(bào)道過組胺可以劑量依賴性地激活MG，產(chǎn)生促炎因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）。H1R和H4R拮抗劑降低了組胺誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，MAPK和PI3K/AKT通路的激活以及線粒體膜電位的喪失［11］。然而在體情況下，組胺合成的抑制劑是否影響脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的MG活化及炎癥因子的產(chǎn)生尚未見報(bào)道。所以本研究以成年雄性大鼠為研究對(duì)象，探討在體條件下HDC抑制劑α-FMH對(duì)LPS引起的大鼠相關(guān)中樞炎癥及認(rèn)知功能障礙的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley（SD）大鼠（12月齡，重300 g左右）購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)（室溫為22 ℃，濕度為50%～60%，晝夜循環(huán)為12 h∶12 h），自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：190913）。

1.1.2 主要試劑與儀器

大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒（R&D公司，美國）；大鼠組胺ELISA試劑盒（Bio Vision公司，美國）；LPS來自大腸桿菌0111：B4（Sigma-Aldrich公司，美國）；Iba-1抗體（Wako公司，日本）；RIPA緩沖液（上海碧云天公司）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素（Gibco公司，美國）；α-FMH（Santa Cruz公司，美國）；蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（Roche公司，瑞士）；立體定位儀（深圳瑞沃德公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥方法

實(shí)驗(yàn)分為兩部分。第1部分：48只SD大鼠隨機(jī)分為2組，LPS處理組42只，經(jīng)腹腔注射LPS（1 mg/kg），分別于注射后2、4、6、8、10、12、24 h各取6只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。生理鹽水組（NS組）6只作為對(duì)照，給予相同體積生理鹽水腹腔注射。第2部分：另取48只SD大鼠隨機(jī)分為4組，分別為Control組、α-FMH組、LPS組、α-FMH+LPS組，每組12只。用50 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，剃毛后放入立體定位儀中并行三角固定。將套管置入大鼠右側(cè)側(cè)腦室，置入坐標(biāo)為前囟后0.8 mm、側(cè)1.5 mm、深度為3.7 mm。植入后給大鼠7 d時(shí)間康復(fù)，每日處理檢查套管情況。在無束縛飼養(yǎng)7 d后，大鼠被放入行為學(xué)儀器中練習(xí)。練習(xí)結(jié)束后通過預(yù)先置入的套管行右側(cè)側(cè)腦室給藥，其中α-FMH組及α-FMH+LPS組注入5 μL的α-FMH（1 μg/μL）；同時(shí)Control組和LPS組經(jīng)套管注入相同體積的生理鹽水。給藥30 min后，LPS組及α-FMH+LPS組大鼠實(shí)施LPS腹腔注射（1 mg/kg），同時(shí)Control組和α-FMH組給予相同體積的生理鹽水。1 d后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠，取其大腦進(jìn)行生化和形態(tài)學(xué)分析。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色

戊巴比妥麻醉大鼠后，灌注250 mL生理鹽水和多聚甲醛。取出大腦用4%多聚甲醛固定24 h，然后用20%和30%的蔗糖梯度脫水。用OCT膠包埋腦組織，固定后連續(xù)切片（10 μm）。取海馬區(qū)的腦片，用PBS液洗去包埋劑（5 min×3次），然后將其放入3%H2O2（63 mL甲醇，7 mL 30% H2O2）中浸泡10 min，然后用PBS洗3次。滴加5%BSA封閉液，室溫下封閉1 h。吸除封閉液后加入1%BSA稀釋后的一抗（1∶200），放入濕盒內(nèi)4 ℃過夜。第2天用PBS洗3遍，滴加對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育1 h洗去多余二抗后加DAB顯色。每只大鼠選取3張海馬CA1區(qū)切片，每張切片光鏡下（×200）拍攝5張照片。細(xì)胞計(jì)數(shù)采用NIH Image J軟件。

1.2.3 ELISA檢測(cè)

切取20 mg的腦組織放入離心管中，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液。于冰上進(jìn)行超聲粉碎，超聲強(qiáng)度30 kHz、單次持續(xù)時(shí)間10 s，間隔時(shí)間5 s，共3個(gè)循環(huán)。將裂解液離心15 min。設(shè)空白孔（樣本稀釋液）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣本孔。每孔先加入樣本稀釋液50 μL，然后再分別加入空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本50 μL，振蕩混勻后加上封膜，室溫下孵育2 h。2 h后揭掉封膜，用洗滌液洗滌，并用吸水紙吸干，重復(fù)此操作5次。然后每孔加入檢測(cè)抗體100 μL，室溫孵育2 h后洗板5次。再每孔加入100 μL底物，室溫孵育30 min，此過程需避光。每孔加入終止液100 μL終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定波長為450 nm，參考波長為570 nm，然后檢測(cè)每孔吸光度。最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-6和TNF-α 的含量。

1.2.4 逃避恐懼實(shí)驗(yàn)

將大鼠放入TFC儀器中讓其自由探索100 s。然后先給予大鼠20 s聽覺刺激（80 db、5 kHz），后立即給予2 s足底電擊（0.8 mA）。重復(fù)2次，中間間隔100 s。刺激結(jié)束后100 s再將大鼠移出儀器，清理儀器底部的排泄物。待給藥后，再將大鼠放回TFC儀器，無聲音及電刺激的干預(yù)評(píng)估其習(xí)得性恐懼記憶。由視頻追蹤軟件（Xeye Fcs，北京天鳴鴻遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司）自動(dòng)記錄大鼠300 s內(nèi)僵直反應(yīng)（除呼吸運(yùn)動(dòng)外無其他任何行為活動(dòng)的狀態(tài)）時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)確定差異顯著性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS腹腔注射對(duì)大鼠海馬區(qū)組胺表達(dá)的影響

大鼠腹腔注射LPS（1 mg/kg）2、4、6、8、10、12、24 h后取其大腦進(jìn)行分析。如圖1所示，腹腔注射LPS后4 h，大鼠海馬區(qū)組胺水平較低，與NS組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。注射后6～24 h組胺表達(dá)明顯升高，與NS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中6 h時(shí)組胺表達(dá)量達(dá)峰值，24 h內(nèi)仍高于基線水平。

2.2 α-FMH可影響LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬區(qū)MG活化

本課題組的前期離體實(shí)驗(yàn)已證明組胺可以劑量依賴性地刺激MG激活［11］，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)大鼠側(cè)腦室注射HDC抑制劑α-FMH，檢測(cè)海馬區(qū)MG的活化情況。如圖2所示，與Control組相比，LPS組與α-FMH+LPS組大鼠海馬區(qū)MG標(biāo)志物Iba1表達(dá)明顯增加；此外與LPS組相比，α-FMH+LPS組Iba1表達(dá)下調(diào)，說明α-FMH可抑制MG的激活。

2.3 α-FMH可影響LPS誘導(dǎo)的大鼠海馬區(qū)炎癥因子的表達(dá)

作為中樞的重要免疫細(xì)胞，MG激活后可釋放大量促炎因子加重中樞炎癥。通過ELISA技術(shù)測(cè)定大鼠海馬區(qū)IL-6和TNF-α的含量。結(jié)果如圖3所示，與Control組相比，LPS組與α-FMH+LPS組大鼠海馬區(qū)炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)增加；與LPS組相比，α-FMH+LPS組炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)顯著下降。以上結(jié)果提示LPS促進(jìn)了海馬區(qū)促炎介質(zhì)的釋放，而α-FMH可以通過降低MG的激活從而部分抑制炎癥介質(zhì)的釋放。

2.4 α-FMH可緩解LPS誘導(dǎo)的大鼠恐懼記憶損傷

圖3 α-FMH對(duì)大鼠海馬區(qū)炎癥因子表達(dá)的影響Figure 3 Effects of α-FMH on the expression of inflammatory cytokines in rat hippocampus

如前所述α-FMH可以降低MG的激活并能抑制炎癥介質(zhì)的釋放從而減輕中樞炎癥，而認(rèn)知功能障礙是術(shù)后中樞炎癥的常見并發(fā)癥。為此我們進(jìn)行了逃避恐懼實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的認(rèn)知功能。結(jié)果如圖4所示，與Control組相比，LPS組大鼠出現(xiàn)了明顯的恐懼記憶損傷，僵立行為的時(shí)間明顯縮短。而與LPS組相比，α-FMH+LPS組大鼠僵立行為的時(shí)間明顯增加，說明α-FMH可緩解LPS誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能下降。

圖4 α-FMH可緩解LPS誘導(dǎo)的大鼠恐懼記憶損傷Figure 4 α-FMH alleviates LPS-induced fear memory impairment in rats

3 討論

全球CNS疾病的發(fā)病率正在迅速增加，CNS病變對(duì)人們生活質(zhì)量的影響愈發(fā)嚴(yán)重［12］。目前普遍認(rèn)為，CNS的紊亂，包括損傷、缺血、感染與中樞炎性反應(yīng)密切相關(guān)［13］。因此，研究中樞炎癥的發(fā)病機(jī)制及防治策略對(duì)于治療CNS疾病及改善患者的預(yù)后具有深遠(yuǎn)的意義。本課題組先前已經(jīng)報(bào)道過原代培養(yǎng)的MG表達(dá)4種類型的組胺受體，其中組胺可上調(diào)H1R和H4R的表達(dá)，誘導(dǎo)MG活化，進(jìn)而釋放炎癥因子如IL-6和TNF-α［11］。然而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)關(guān)于組胺在LPS誘導(dǎo)的MG激活、神經(jīng)炎癥和認(rèn)知障礙中的作用尚未得到闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，α-FMH可以抑制LPS誘導(dǎo)的MG活化和神經(jīng)炎癥，并減輕了大鼠的認(rèn)知功能障礙。

神經(jīng)科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)和CNS之間存在雙向信息交流，MG釋放的促炎因子在這種交流中起著關(guān)鍵作用。MG的激活是神經(jīng)元壞死及CNS退行性疾病的早期預(yù)兆。研究發(fā)現(xiàn)LPS、組胺和IL-10等多種物質(zhì)均可以引起MG的激活，并誘導(dǎo)向M1表型及M2表型之間轉(zhuǎn)換［14］。組胺作為中樞重要的神經(jīng)遞質(zhì)其在MG介導(dǎo)的中樞炎癥中發(fā)揮重要作用［15-16］。腦組胺不僅存在于神經(jīng)元中，也存在于大腦肥大細(xì)胞中，Dong等［17］證實(shí)給予肥大細(xì)胞的穩(wěn)定劑可抑制LPS誘導(dǎo)的MG活化和神經(jīng)炎癥，并減輕LPS誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙。此外早有在大鼠黑質(zhì)中注射組胺可以誘導(dǎo)MG活化的報(bào)道［18］。然而目前關(guān)于4種組胺受體在MG介導(dǎo)的炎癥中如何發(fā)揮作用尚未完全闡明。

LPS腹腔注射的大鼠是CNS炎癥的最常用動(dòng)物模型。LPS外周給藥可誘導(dǎo)大鼠MG活化及促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加［19］。參考相關(guān)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們最終選擇腹腔注射LPS的劑量為1 mg/kg，實(shí)驗(yàn)大鼠均成功存活。本研究首先觀察了大鼠腹腔注射LPS 1 mg/kg后，腦內(nèi)組胺隨時(shí)程變化的表達(dá)情況。結(jié)果提示與生理鹽水組相比，6～24 h大鼠海馬區(qū)組胺表達(dá)明顯增多，其中6 h達(dá)峰值，24 h仍高于生理鹽水組。Wang等［20］給予大鼠腹腔注射LPS 2 mg/kg，發(fā)現(xiàn)組胺在6～24 h表達(dá)明顯增多，這與我們的結(jié)果相一致。

為了進(jìn)一步探索α-FMH在LPS誘導(dǎo)的中樞炎癥及認(rèn)知功能中的作用，我們進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將5 μL的α-FMH（1 μg/μL）注入大鼠右側(cè)側(cè)腦室，30 min后行LPS腹腔注射，1 d后檢測(cè)大鼠海馬區(qū)MG活化及炎癥因子的表達(dá)情況。有文獻(xiàn)指出在外周給予LPS刺激后，海馬區(qū)域的Iba1免疫反應(yīng)活性增加［21］。Norden等［22］報(bào)道給予LPS后4 h，大鼠即表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)能力降低，這與MG被過度激活，釋放炎癥因子有關(guān)。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS組大鼠海馬區(qū)MG標(biāo)志物Iba1明顯增加，而α-FMH預(yù)處理明顯抑制了海馬區(qū)MG的活化，同時(shí)與LPS組相比，α-FMH+LPS組大鼠海馬區(qū)炎癥因子的表達(dá)也顯著下調(diào)。已知認(rèn)知功能障礙是中樞炎癥的常見并發(fā)癥，為此我們進(jìn)一步進(jìn)行了行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來評(píng)估各組大鼠的認(rèn)知功能［23］。逃避恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPS組大鼠出現(xiàn)了明顯的恐懼記憶損傷，而α-FMH+LPS組大鼠的恐懼記憶損傷明顯得到改善。以上結(jié)果提示α-FMH在MG相關(guān)的炎癥反應(yīng)及炎性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，本研究通過在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明組胺在MG的激活及隨后產(chǎn)生各種促炎因子發(fā)揮重要作用，而α-FMH可以通過抑制MG的活化改善LPS誘導(dǎo)的大鼠相關(guān)炎癥與認(rèn)知功能障礙。但是本實(shí)驗(yàn)只使用組胺合成的抑制劑，沒有使用組胺合成的激動(dòng)劑反向證明，且沒有在體開展組胺與MG作用相關(guān)的通路機(jī)制研究，這將作為我們下一步的研究目標(biāo)。