陳 績，楊傳熙，徐天華，孫 偉，孔祥清，盛燕輝*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 南京 210029；2東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 211189

冠心病是臨床最常見的心血管系統(tǒng)疾病之一［1］，也是世界范圍內(nèi)的主要致死疾?。?-4］。多數(shù)重癥冠心病患者臨床往往采用冠狀動脈介入手術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）治療，但存在慢性全閉塞（chronictotal occlusion，CTO）和嚴重鈣化病變等隱患，導(dǎo)致手術(shù)風(fēng)險較大［5］。盡管已有相對成熟的臨床用藥［6］，但藥物治療往往存在藥物抵抗［7］及不良反應(yīng)［8］等問題，長期應(yīng)用可能會對身體造成損傷。我國冠心病病死率呈上升趨勢，特別是農(nóng)村地區(qū)，病死率上升明顯。對冠心病的診治需要日益強化的同時，仍存在因經(jīng)濟問題患者自行停藥、拒絕手術(shù)的情況，冠心病的醫(yī)療費用負擔是造成患者治療依從性差的重要原因。急需探索和完善安全、無創(chuàng)、低價的物理治療手段。

巨噬細胞主要擁有參與炎癥的M1型和抗炎的M2型兩個極化方向［9］，其炎癥極化方向和吞脂能力的變化，會影響泡沫細胞的形成和血管斑塊脂質(zhì)沉積［10-11］，是冠心病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［12］，因此抑制巨噬細胞向M1型方向極化和減弱其吞脂能力可能成為治療冠心病的關(guān)鍵策略之一。

超聲治療利用超聲波在組織中傳播所產(chǎn)生的熱效應(yīng)、機械效應(yīng)等生物效應(yīng)達到治療效果，是近年來凸顯的一種新型治療手段，目前主要處于實驗研究階段。其中較高頻率的超聲波穿透能力差，傳遞過程中易發(fā)生較多的能量衰減，導(dǎo)致到達治療部位的能量達不到治療數(shù)量級，一些學(xué)會判定高頻超聲的療效不確定，越來越多的學(xué)者將關(guān)注轉(zhuǎn)向了低強度脈沖式超聲波（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）。LIPUS由于頻率較低，強度不高，因而在組織中傳播時聲能衰減低，被組織吸收少。它所產(chǎn)生的熱效應(yīng)和對組織的升溫作用均接近于可忽略的程度，主要通過機械效應(yīng)起到治療作用。這種聲波以壓力波的形式存在，可對組織細胞產(chǎn)生微型壓力作用［13］。本實驗擬在體外通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)巨噬細胞的炎癥模型，采用不同強度的LIPUS進行處理，探討LIPUS對巨噬細胞M1型極化和吞脂能力的影響及其分子機制，為冠心病臨床無創(chuàng)治療的新方法提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）（R&D公司，美國），LPS（Sigma公司，美國），DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），青霉素、鏈霉素、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Biological Industries公司，以色列），TRIzol試劑（Bioflux公司，日本），DEPC水、CCK-8試劑（日本Dojindo公司），SybrGreen qPCR Master Mix（含Rox）、雙蒸水（doble distilled water，ddH2O，日本TaKaRa公司），SYBR Green熒光染料、流式細胞術(shù)分析試劑盒（ThermoFisher公司，美國），苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（ICN生物醫(yī)學(xué)化學(xué)藥品公司，美國），DiI標記的氧化低密度脂蛋白（DiI-Ox-LDL）（廣州奕元生物技術(shù)有限公司），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司），GAPDH抗體、p65抗體、p-p65抗體、p38抗體、pp38抗體、JNK抗體、p-JNK抗體、ERK抗體，p-ERK抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 原代小鼠骨髓來源的巨噬細胞分離與培養(yǎng)

脊髓脫臼處死6周齡C57BL/6小鼠（實驗動物倫理批準號：IACUC-2008020），酒精浸泡，取脛骨剪斷遠端，注射器吸取培養(yǎng)基插入脛骨近端，沖洗出骨髓原代前體細胞，添加GM-CSF使其成熟為原代巨噬細胞，37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.2 LIPUS輻照細胞

與前期研究［14］一致，實驗采用超聲設(shè)備（Agilent Technologies，Santa Clara，美國）發(fā)射LIPUS對巨噬細胞進行輻照處理。超聲參數(shù)：頻率0.5 MHz，電壓50～150 mVpp，聲強4.825～43.425 mW/cm2，時長20 min，每天2次，每次間隔6 h。超聲后以LPS（100 μg/mL）誘導(dǎo)24 h后進行下一步處理。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況

將LIPUS輻照處理后的各組細胞移至裝有DMEM培養(yǎng)基的15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加預(yù)冷PBS重懸，1 000 r/min離心5 min，重復(fù)此操作3遍后棄上清，倒置離心管，吸干PBS。對照組避光加入500 μL緩沖液，按每支流式管100 μL分為空白對照1管、單加碘化丙啶（propidium iodide PI）1管、單加膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）1管、雙加PI/Annexin V 2管，其余輻照處理組加入200 μL緩沖液平均分為兩管，加入PI/Annexin V。每管避光孵育15 min，加入300 μL緩沖液吹打均勻，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活性

將LIPUS輻照處理后各組細胞按每組4孔，每孔100 μL DMEM培養(yǎng)基，每孔細胞計數(shù)1.5×103的密度布板細胞懸液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后避光將每孔中的舊培養(yǎng)基換為10 μL CCK-8+100 μL DMEM培養(yǎng)基的混合液，于等量空白孔里也加110 μL混合液用于對比參照。溫箱孵育2 h后，使用酶標儀檢測LIPUS輻照處理下巨噬細胞活性。

1.2.5 LIPUS輻照熱效應(yīng)檢測

將培養(yǎng)皿放置于超聲輻照探頭上，確保接觸緊密。連接測溫儀與測溫針，測試校準后，固定測溫針頂端接觸培養(yǎng)皿底部正中心，設(shè)定測溫記錄參數(shù)為1 s采集2次，采集20 min，進行LIPUS熱效應(yīng)檢測。

1.2.6 實時熒光定量PCR（qPCR）

LPS（100 μg/mL）誘導(dǎo)24 h后收取RNA，進行PCR檢測，具體方法如下：每6 cm皿添加1 mL TRIzol試劑，充分研磨后移液至1.5 mL EP管，每管添加200 μL氯仿震蕩后12 000g4 ℃離心15 min，移上層無色水相至另一EP管，加等體積異丙醇12 000g4 ℃離心10 min，棄上清加75%乙醇1 mL，顛倒后7 500g4 ℃離心10 min，棄上清液，濾紙吸取殘留液體室溫干燥10 min，沉淀溶于DEPC水，分光光度計計算所得RNA濃度與純度，于10 μL EP管中按總RNA 500 ng添加對應(yīng)體積RNA，補充適量DEPC水使總體積達到8 μL，于管中加入2 μL SybrGreen qPCR Master Mix（含Rox），震蕩離心，使用逆轉(zhuǎn)錄儀按程序參數(shù)：35 ℃15 min，85 ℃5 s將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按2.5 μL SYBR、0.05 μL上游引物、0.05 μL下游引物，2.4 μL cDNA的5 μL體系加樣，遵循兩步法程序參數(shù)設(shè)定PCR反應(yīng)循環(huán)，95 ℃10 min進行預(yù)變性；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40個循環(huán)，用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。

表1 PCR引物Table 1 Primers for PCR

1.2.7 Western blot

LPS（100 μg/mL）誘導(dǎo)24 h后收取蛋白，具體方法如下：蛋白裂解液按90∶1添加PMSF后，每6 cm皿添加80 μL蛋白裂解液，充分研磨后移液至1.5 mL EP管，冰上裂解30 min，12 000g離心15 min去除雜質(zhì)取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液煮沸5～6 min。配制10%SDS-PAGE凝膠，電泳至蛋白條帶分隔清晰。分離后的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，BSA溶液封閉2 h，于一抗中4 ℃孵育過夜，次日于對應(yīng)二抗中孵育2 h、洗脫20 min后，曝光顯現(xiàn)蛋白條帶。

1.2.8 脂滴吞噬染色

細胞每皿添加2.0 mg/mL的DiI-Ox-LDL 3 mL，避光37 ℃培養(yǎng)3 h后，吸盡含DiI-Ox-LDL的培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，ddH2O室溫沖洗5 s，每皿添加3 mL PBS。熒光倒置顯微鏡下拍攝細胞脂滴吞噬圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均重復(fù)3次，采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用軟件Graphpad prism 7繪制圖表。數(shù)據(jù)處理時，計量資料經(jīng)檢驗，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，結(jié)果以均數(shù)±標準差（）表示。多組之間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LIPUS對小鼠骨髓來源巨噬細胞凋亡與活性的影響

為了檢測所用超聲強度對巨噬細胞凋亡的影響，實驗通過流式細胞術(shù)檢測了巨噬細胞凋亡狀態(tài)的變化。不同強度（4.825、19.300、43.425 mW/cm2）的LIPUS輻照處理巨噬細胞后，與對照組對比，凋亡細胞所占比例未有明顯變化（圖1A）。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與同時間點對照組相比，LIPUS輻照處理的小鼠骨髓來源巨噬細胞活性未出現(xiàn)明顯差異（圖1B）。此外，實驗通過熱電偶測溫技術(shù)檢測了LIPUS輻照過程中細胞培養(yǎng)基溫度變化情況。測溫數(shù)據(jù)顯示，20 min的LIPUS輻照處理過程中，培養(yǎng)基溫差穩(wěn)定在±1 ℃（圖1C），超聲輻照過程中未產(chǎn)生明顯的熱效應(yīng)。

圖1 LIPUS對小鼠骨髓來源巨噬細胞凋亡與活性的影響Figure 1 Effects of LIPUS on apoptosis and viability of murine bone marrow-derived macrophage

2.2 LIPUS對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型分化的作用

為了檢測LIPUS對巨噬細胞極化的作用，實驗通過qPCR技術(shù)檢測了M1型巨噬細胞標志基因白介素（interleukin，IL）-6、IL-23α、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的mRNA水平變化。實驗使用LPS（100 μg/mL）誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化，結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)能夠顯著上調(diào)巨噬細胞IL-6、IL-23α、TNF-α、iNOS的mRNA水平。與LPS誘導(dǎo)組相比，LIPUS輻照后能夠下調(diào)LPS誘導(dǎo)的IL-6、IL-23α、TNF-α、iNOS的mRNA水平（圖2）。

2.3 LIPUS對M1型巨噬細胞吞噬效率的影響

為了檢測LIPUS對M1型巨噬細胞吞噬能力的影響，將巨噬細胞與DiI-Ox-LDL共培養(yǎng)24 h后，通過熒光顯微鏡觀察巨噬細胞的吞脂能力。Image J軟件分析可得對照組、LPS（100 μg/mL）組、LPS+4.825 mW/cm2組、LPS+19.300 mW/cm2組、LPS+43.425 mW/cm2組吞脂效率分別為（60.9±1.9）%、（72.7±1.2）%、（28.6±7.1）%、（43.1±2.6）%、（27.3±1.8）%，結(jié)果顯示，與LPS組相比，LIPUS輻照處理明顯降低了LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞的吞脂能力（圖3）。

2.4 LIPUS對巨噬細胞NF-кB/MAPK信號通路活化的影響

為了闡明LIPUS抑制巨噬細胞M1型極化和減弱巨噬細胞吞脂能力的機制，實驗通過Western blot技術(shù)檢測了NF-κB和MAPK通路信號分子的變化。與對照組相比，LPS明顯誘導(dǎo)了NF-κB/MAPK信號通路的活化，增強了p38、ERK、JNK和p65的磷酸化。而LIPUS輻照處理后，下調(diào)了NF-κB/MAPK通路p-p38、p-ERK、p-JNK和p-p65的蛋白水平（P＜0.05，圖4），進一步提示LIPUS可能通過NF-κB/MAPK信號通路來調(diào)控巨噬細胞的極化和吞脂能力。

圖2 LIPUS對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型分化的作用Figure 2 Effects of LIPUS on polarization of LPS-induced macrophage to the M1 phenotype

圖3 LIPUS對M1型巨噬細胞吞噬效率的影響Figure 3 Effects of LIPUS on phagocytosis efficiency of M1 phenotype macrophage

3 討論

LIPUS作為超過人類聽閾范圍的高頻聲波，以壓力波的形式存在，可對組織細胞產(chǎn)生微型壓力作用［13］。LIPUS的空化效應(yīng)［15］已被應(yīng)用于腫瘤抑制［16］、穿透血腦屏障［17］等領(lǐng)域。在心血管領(lǐng)域，Charles等［18］研究發(fā)現(xiàn)通過脾和頸部脈沖超聲可明顯減少急性高血糖心肌梗死面積，其治療效果可能是通過膽堿能抗炎途徑發(fā)揮作用。此類研究更側(cè)重于冠心病發(fā)展到重癥階段時，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)生后，LIPUS對心梗面積的恢復(fù)作用。AMI發(fā)作急驟且病程已發(fā)展至晚期，往往導(dǎo)致較為嚴重的預(yù)后，且對于輕中癥患者關(guān)注不足，沒有起到發(fā)病前預(yù)防的效果。已有研究指出，冠心病患者病情的早期發(fā)現(xiàn)早期干預(yù)具有重要的意義［19］。同時，此類文章往往以整體器官作為研究對象，實驗結(jié)果可能會受到個體發(fā)育與手術(shù)操作效果的影響，對于慢性冠心病脂質(zhì)沉積發(fā)展過程中，LIPUS對巨噬細胞本身造成的炎癥極化方向和吞脂能力改變并未給予太多關(guān)注。而在人體炎癥過程中，巨噬細胞向M1型方向極化，吞脂能力增強，最終形成泡沫細胞沉積于動脈內(nèi)膜之下的過程，是冠心病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。過往研究表明，LIPUS能夠被用于治療病毒性心肌炎［20］、心臟功能障礙［21］等疾病。但LIPUS是否能通過作用于巨噬細胞對其極化方向和吞脂能力產(chǎn)生影響，目前仍然未見報道。本文首次闡明LIPUS對小鼠骨髓來源巨噬細胞極化和吞脂能力的影響。

圖4 LIPUS對巨噬細胞NF-кB/MAPK信號通路活化的影響Figure 4 Effects of LIPUS on activation of NF-кB/MAPK pathways in macrophage

冠心病是一種炎癥性、代謝性疾病，主要由動脈粥樣硬化引起。脂質(zhì)代謝異常和炎癥在動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［22］，二者高度相關(guān)［23］。有資料表明，相比膽固醇的累積，炎癥被認為在發(fā)病過程中的作用更為關(guān)鍵［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，輻照強度達到43.425 mW/cm2時，LIPUS不僅下調(diào)了LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細胞標志基因的mRNA水平，同時減弱了M1型巨噬細胞的脂質(zhì)吞噬能力，這證明了LIPUS具有通過巨噬細胞發(fā)揮抗炎、降脂質(zhì)積累的效果，可能對冠心病起到進一步預(yù)防與治療作用。

NF-κB/MAPK信號通路是影響炎癥極化最為重要的信號通路之一，通路的激活往往意味著細胞的極化方向更大比例轉(zhuǎn)為致炎M1方向［25］，可能影響巨噬細胞對脂滴的吞噬能力。實驗中對巨噬細胞p38、JNK、ERK、p65的磷酸化水平進行檢測。Western blot結(jié)果顯示，LIPUS能夠下調(diào)LPS誘導(dǎo)的pp38、p-JNK、p-ERK和p-p65的蛋白水平，表明LIPUS可能是通過抑制NF-κB/MAPK信號通路的活化來起到治療效果。未來診療中在單獨通過LIPUS起到冠心病防控的同時，可以通過配合已有的超聲空化效應(yīng)研究和傳統(tǒng)臨床藥物、手術(shù)，起到聯(lián)合治療的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LIPUS可抑制小鼠來源的巨噬細胞向M1型極化以及減弱M1型巨噬細胞的吞脂能力，其機制可能與抑制LPS活化的NF-κB/MAPK通路有關(guān)。為臨床預(yù)防與治療冠心病，降低血管脂質(zhì)沉積提供了新的思路。