尚彥星，周 蒙，鄂裘愷，張曉倩，張學(xué)森

南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166

下丘腦-垂體-卵巢軸（hypothalamic-pituitaryovarian axis，HPOA）是影響雌性生殖能力的重要調(diào)控因素，在生殖功能中發(fā)揮主要的調(diào)節(jié)作用。卵巢作為雌性性腺器官，主要功能在于產(chǎn)生卵子和性激素，接受下丘腦和垂體激素的調(diào)節(jié)，同時(shí)反饋性調(diào)節(jié)下丘腦及垂體的功能［1］。促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GNRH）神經(jīng)元分泌GNRH，調(diào)節(jié)垂體中促性腺細(xì)胞分泌卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促黃體生成素（luteinizing hormone，LH），GNRH的脈沖式釋放是促性腺激素呈周期變化的必需條件，可以確保卵泡的正常發(fā)育和生殖功能［2］。許多文章也報(bào)道了下丘腦和垂體激素對(duì)排卵和卵巢激素分泌等卵巢功能的調(diào)節(jié)［3-4］。然而，盡管一些研究描述了迷走副交感神經(jīng)和交感神經(jīng)對(duì)卵巢的支配［5-6］，但是這些自主神經(jīng)在卵巢功能中的參與尚不清楚。

Ninjurins家族蛋白分子量為16～27 kDa，在哺乳動(dòng)物中有Ninjurin1（Ninj1）和Ninjurin2（Ninj2）兩個(gè)成員，兩者共享保守的疏水區(qū)跨膜結(jié)構(gòu)域，均可促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞和背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)［7-9］。Ninj1廣泛存在于成年和胚胎組織中，特別是具有上皮起源的組織，并在其他組織的形成和功能中發(fā)揮作用，例如神經(jīng)元發(fā)育以及神經(jīng)再生［9-14］。Ninj2在所有感覺(jué)神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和腸神經(jīng)元中均表達(dá)豐富，并且神經(jīng)損傷后Ninj2在施萬(wàn)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)［7］。通過(guò)查詢PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)Ninj2基因在卵巢中高表達(dá)，我們猜測(cè)Ninj2可能參與神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)卵巢功能的調(diào)控。因此，本研究擬通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除小鼠模型，研究Ninj2在小鼠卵巢發(fā)育中的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

C56BL/6J小鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（批準(zhǔn)編號(hào)IACUC-1705008），按照無(wú)特定病原體（SPF）條件，室溫保持在（23 ± 2）℃，室內(nèi)相對(duì)濕度在（50±5）%，小鼠飼養(yǎng)于12 h光照和12 h黑暗交替環(huán)境。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

TRIzol、SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司，美國(guó)）；SYBR Green Master Mix（南京Vazyme公司）；瓊脂糖（南京擎科公司）；DDX4抗體（1∶200，Abcam公司，英國(guó)）；熒光二抗Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch，美國(guó)）；人輸卵管液（human tubal fluid，HTF）、Embryo Max Advanced KSOM Embryo Medium（KSOM）（Sigma公司，美國(guó)）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（上海翊圣公司）；絨毛膜促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）（寧波第二激素廠）；EDTA抗原修復(fù)液（上海碧云天）；DAPI（Invitrogen公司，美國(guó)）；LPS（北京索萊寶公司）。PCR引物及sgRNA序列均由安徽通用公司合成。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建敲除小鼠模型

取成年C57BL/6J小鼠6只（雄性2只，雌性4只）構(gòu)建Ninj2敲除小鼠模型。設(shè)計(jì)sgRNA序列，sgRNA-F：5′-CCAAGAAGAGTGTGGCAGAGAGC-3′，sgRNA-R：5′-GCTGCAGCAAGGGCCATTCGCGG-3′。CRISPR/Cas9在體外轉(zhuǎn)錄和顯微注射根據(jù)文章所述［15-16］，將Cas9 mRNA和sgRNA同時(shí)注射到合子期受精卵中，然后移植到假孕小鼠子宮，最終通過(guò)雜合突變雌雄小鼠之間的交配得到純合敲除小鼠。

1.2.2 基因型鑒定

剪取小鼠腳趾1～2 mm進(jìn)行基因型鑒定，Ninj2基因型鑒定引物如下，msNinj2-F：5′-GCTGTCACTGTCACCCAAGA-3′，msNinj2-R：5′-CACCCATGGGATATGAGGAG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃5 min預(yù)變性；95 ℃30 s變性，56 ℃30 s退火，72 ℃30 s延伸，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min終延伸；4 ℃保存。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

用TRIzol提取小鼠卵巢總RNA，利用Super-Script Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶將500 ng總RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA；使用SYBR Green Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)情況。Ninj2上游引物：5′-GCAAAGTCCTGAAGGATGCAC-3′，下游引物：5′-TAAAGAGCGCCACGTCTAGC -3′；GAPDH上游引物：5′-AGGTTGTCTCCTGCGACTTCA -3′，下游引物：5′-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTACT-3′。使用ABI 7500儀器進(jìn)行PCR反應(yīng)：95 ℃2 min；95 ℃30 s，60 ℃60 s，40個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。每個(gè)樣品均重復(fù)3個(gè)反應(yīng)。根據(jù)公式2-ΔΔCT計(jì)算Ninj2 mRNA表達(dá)量。

1.2.4 體外受精（in vitrofertilization，IVF）

3～4周齡雌鼠注射馬PMSG；46 h后注射HCG，提前備好獲能、受精、清洗以及KSOM培養(yǎng)液滴；HCG注射后12 h先將精子獲能，從附睪及輸精管擠出精子放入獲能液滴，放入培養(yǎng)箱獲能1.5 h；顯微鏡下將雌鼠輸卵管放入石蠟油中，用針尖戳破輸卵管膨大部，使卵丘團(tuán)溢出，移至受精液滴；將獲能后的精子取5～10 μL精液放入受精液滴，記下時(shí)間，受精3～5 h后，觀察受精情況，將受精卵在洗液清洗后轉(zhuǎn)入KSOM培養(yǎng)液滴，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

獲能及受精液滴：按照HTF 1 mL+0.01 g BSA的比例進(jìn)行稱量溶解，渦旋混勻，0.22 μm濾器過(guò)濾。

1.2.5 HE染色

組織切片脫蠟水化后用雙蒸水清洗3次，每次5 min，然后在蘇木素中浸染2～3 min，伊紅染色4 min，梯度酒精脫水后樹(shù)脂封片。

1.2.6 免疫熒光染色

培養(yǎng)后的卵巢組織在10%中性福爾馬林溶液中室溫固定過(guò)夜。石蠟包埋后5 μm厚度連續(xù)切片。切片組織進(jìn)行脫蠟、水化；EDTA抗原修復(fù)液95 ℃水浴修復(fù)20 min，自然冷卻至室溫；PBS洗3次，每次5 min；然后用10%山羊血清室溫封閉2 h；輕輕甩掉片子上多余水分，滴加10%山羊血清配制的一抗DDX4置于濕盒內(nèi)，4 ℃孵育過(guò)夜；次日，用PBS徹底沖洗切片后用免疫熒光二抗室溫孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min。DAPI染細(xì)胞核15 min，PBS清洗后加防淬滅劑進(jìn)行封片。用激光共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.2.7 小鼠脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）暴露

6周齡的雌性野生型小鼠和純合敲除小鼠各5只，腹膜內(nèi)注入100 μg血清型超純LPS（溶解于100 μL生理鹽水），處理以5 d為1個(gè)周期，共處理4次，在最后一次處理結(jié)束的第5天收樣進(jìn)行檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。通過(guò)摘眼球取血的方法采集小鼠全血，室溫靜置后，離心分離血清，使用血液生化儀檢測(cè)相關(guān)生化指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、肌酐（creatinine，CREA）、谷酰轉(zhuǎn)氨酶（γglutamyl transpeptidase，GGT）、葡萄糖（glucose，GLU）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、甘油三酯（triglyceride，TG）、尿酸（uric acid，UA），共14項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建Ninj2基因敲除小鼠

圖1 Ninj2基因表達(dá)情況與敲除小鼠構(gòu)建Figure 1 Ninj2 gene expression and construction of knock out mice

通過(guò)qPCR對(duì)不同組織來(lái)源的Ninj2 mRNA水平進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)一致，Ninj2在卵巢中高表達(dá)（圖1A）。隨后，借助CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Ninj2基因敲除小鼠（圖1B）。對(duì)4只子代新生小鼠（編號(hào)為1～4）進(jìn)行基因型鑒定，并結(jié)合qPCR檢測(cè)Ninj2敲除效率（圖1C、D），結(jié)果均證明Ninj2敲除鼠構(gòu)建成功。

2.2 Ninj2敲除小鼠全身表型分析

首先，我們?nèi)?周齡野生型和Ninj2純合敲除雌鼠各5只，純合敲除鼠卵巢體重比與野生型小鼠無(wú)明顯差異（表1），通過(guò)對(duì)Ninj2敲除小鼠的生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，與野生型相比，6周齡Ninj2純合敲除雌鼠血清中ALT、GLU、BUN、TC、UA等指標(biāo)無(wú)明顯差異，說(shuō)明純合敲除小鼠健康狀況良好。

2.3 Ninj2敲除小鼠生育信息分析

對(duì)Ninj2缺失的小鼠出生比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠出生比例符合孟德?tīng)栠z傳定律（圖2A）；通過(guò)對(duì)3種基因型小鼠體重的連續(xù)稱量，發(fā)現(xiàn)與野生型和雜合型相比，敲除小鼠體重?zé)o顯著性差異（圖2B）；經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析配繁21周Ninj2敲除小鼠的子代累計(jì)出生數(shù)量，發(fā)現(xiàn)Ninj2敲除小鼠累計(jì)產(chǎn)仔數(shù)與野生型與雜合小鼠相比沒(méi)有差異（圖2C）。由此可以說(shuō)明，Ninj2敲除不影響小鼠生育力及仔鼠發(fā)育。

表1 Ninj2敲除小鼠全身表型分析Table l Analysis of whole body phenotype of Ninj2 knockout mice

2.4 Ninj2敲除小鼠表型分析

圖2 Ninj2敲除小鼠生育信息分析Figure 2 Analysis of fertility information of Ninj2 knockout mice

首先，我們從形態(tài)學(xué)角度對(duì)卵巢發(fā)育情況進(jìn)行了分析。通過(guò)免疫熒光染色與卵泡計(jì)數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)Ninj2敲除小鼠新生卵巢中卵泡激活情況與野生型對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差別（圖3A、B）。通過(guò)對(duì)成年6周齡敲除小鼠卵巢進(jìn)行HE染色和卵泡計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)Ninj2敲除小鼠成年卵巢中卵泡數(shù)量和對(duì)照組相比沒(méi)有異常（圖3C、D），以上數(shù)據(jù)均表明敲除Ninj2不影響雌性小鼠的生殖發(fā)育。為進(jìn)一步排除Ninj2是否在胚胎發(fā)育過(guò)程中存在異常現(xiàn)象，我們對(duì)Ninj2純合敲除小鼠進(jìn)行了IVF實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，Ninj2敲除對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程沒(méi)有影響（圖3E）。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明敲除Ninj2不影響小鼠的卵巢發(fā)育過(guò)程。

2.5 LPS處理Ninj2敲除小鼠表型分析

已有文獻(xiàn)報(bào)道，Ninj2在LPS刺激的人血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和小鼠主動(dòng)脈中的表達(dá)上調(diào)［17］，我們猜測(cè)Ninj2可能參與LPS引發(fā)的炎癥反應(yīng)。因此，我們對(duì)成年6周齡敲除小鼠進(jìn)行為期20 d的LPS處理，觀察炎癥條件下Ninj2敲除是否影響小鼠卵巢發(fā)育。通過(guò)小鼠LPS定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）對(duì)處理的小鼠血液中LPS表達(dá)含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明LPS含量顯著升高，表明LPS誘導(dǎo)炎癥模型成功（圖4A）。通過(guò)卵巢HE染色和卵泡計(jì)數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)LPS處理后Ninj2敲除小鼠成年卵巢中卵泡數(shù)量和野生型對(duì)照組相比基本一致（圖4B、C），以上數(shù)據(jù)表明LPS處理對(duì)Ninj2敲除小鼠的卵巢發(fā)育過(guò)程沒(méi)有影響。

3 討論

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們證明了Ninj2在小鼠卵巢中特異性高表達(dá)。為了研究Ninj2在雌性小鼠生殖發(fā)育中的作用，借助CRISPR/Cas9技術(shù)，我們成功構(gòu)建了Ninj2基因敲除小鼠模型。通過(guò)分析小鼠生育信息，我們發(fā)現(xiàn)敲除Ninj2不影響純合小鼠的出生比例、體重和小鼠生育力，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Ninj2敲除小鼠的卵巢功能正常，并且胚胎發(fā)育正常，受精卵可以正常發(fā)育。綜上所述，在正常生理?xiàng)l件下，敲除Ninj2不影響雌性小鼠生殖發(fā)育。

圖3 Ninj2敲除小鼠表型分析Figure 3 Phenotypic analysis of Ninj2 KO mice

圖4 LPS處理Ninj2敲除小鼠表型分析Figure 4 Phenotype analysis of Ninj2 knockout mice treated with LPS

在有絲分裂分化后的神經(jīng)元中Ninj2的表達(dá)顯著升高，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Ninj2被觀察到在放射狀神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。周圍神經(jīng)損傷后，Ninj2在遠(yuǎn)端神經(jīng)節(jié)段的Schwann中上調(diào)，并且通過(guò)Ninj2介導(dǎo)的同源細(xì)胞相互作用促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的神經(jīng)突生長(zhǎng)［7］。Ninj2可以調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮激活和單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，Ninj2可直接與Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）相互作用，對(duì)TLR4介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞激活通路至關(guān)重要［17］。在小鼠中LPS增加了卵泡閉鎖，這一過(guò)程是TLR4依賴性的，這些TLR4在包括卵巢囊在內(nèi)的多種組織中廣泛表達(dá)［18-19］。環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素可能引發(fā)或加劇卵巢病變［20］。因此，為了確定Ninj2敲除小鼠是否會(huì)受炎癥的影響，我們對(duì)Ninj2敲除小鼠進(jìn)行了LPS處理，結(jié)果顯示LPS處理對(duì)Ninj2敲除小鼠卵巢發(fā)育沒(méi)有明顯影響。另外，我們注意到Ninjurins家族蛋白在哺乳動(dòng)物中有Ninj1和Ninj2兩個(gè)成員，文獻(xiàn)報(bào)道Ninj1在卵巢中沒(méi)有表達(dá)，而在內(nèi)皮細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和各種器官（腎臟、肝臟、胸腺、脾臟和腎上腺）中基本有表達(dá)［11，13，21］。因此，我們排除了Ninj1在Ninj2敲除后起代償作用的可能性。后續(xù)我們將繼續(xù)尋找其他環(huán)境刺激，通過(guò)具體的實(shí)驗(yàn)研究，明確Ninj2在小鼠卵巢發(fā)育中的功能。