張舒純，張 昕，李景云，池 霞，3，童梅玲*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院（南京市婦幼保健院）兒童保健科，2醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇 南京 210004；3南京醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)院，江蘇 南京 210029

多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCBs），作為一種常見的環(huán)境污染物，會對兒童的視覺發(fā)育造成影響。研究表明，誤食PCBs污染的食物會導(dǎo)致子代出現(xiàn)眶周水腫、視力下降、視功能減低等表現(xiàn)［1-2］。前期實驗表明，PCBs暴露可導(dǎo)致子代斑馬魚畸形率和死亡率明顯升高，子代斑馬魚視網(wǎng)膜形態(tài)異常，導(dǎo)致其視動反應(yīng)敏感性降低，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的增殖并促進其凋亡［3-4］，PCB1254可以通過抑制miR-182的表達來影響RGC-5細胞的增殖和凋亡［5］。然而，PCBs暴露導(dǎo)致視網(wǎng)膜尤其是神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育異常的具體機制尚不明確。軸突導(dǎo)向因子-1（netrin-1，NTN1）作為一種神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。NTN1可通過介導(dǎo)視神經(jīng)乳頭，與視神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)，其缺失會造成視神經(jīng)乳頭發(fā)育不良，細胞減少，視杯發(fā)育不全［6-7］。因此，本研究以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5為研究對象，探討NTN1在PCBs暴露致子代視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育異常中的作用機制，從而為環(huán)境污染物暴露致子代視網(wǎng)膜發(fā)育異常的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞株RGC-5購自美國ATCC細胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青鏈霉素、0.25%胰酶（Thermo公司，美國）；PCB1254、Lip3000、聚凝胺（polybrene）（Sigma公司，美國）；ERK、p-ERK抗體和山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)抗體（CST公司，美國）、GAPDH抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）、β-actin和NTN1抗體（Abcam公司，美國）；CCK-8試劑盒（同仁公司，日本）；細胞周期檢測試劑盒（蘇州宇恒生物科技有限公司）；總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司，美國）；NTN1過表達慢病毒及小干擾RNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；NTN1擴增引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

配制含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠RGC-5細胞，置于37 ℃、含5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，待細胞長至80%融合時傳代。調(diào)整細胞密度為5×106個/L接種至6孔板內(nèi)，待細胞長至70%融合時進行染毒或轉(zhuǎn)染。

1.2.2 PCB1254染毒液配制及染毒

PCB1254以甲醇為助溶劑配制成濃度為1.0 g/L的儲備液備用，4 ℃冰箱儲存。前期研究得出PCB1254對RGC-5細胞半數(shù)致死量（LC50）為3.409 mg/L（數(shù)據(jù)未發(fā)表），使用DMEM完全培養(yǎng)基將1.0 g/L的儲備液稀釋成4個工作濃度，分別是0.625、1.250、2.500和5.000 mg/L，并設(shè)立空白對照組及0.01%甲醇對照組。

1.2.3 小干擾RNA轉(zhuǎn)染細胞及慢病毒感染細胞

調(diào)整細胞濃度為5×106個/L接種至6孔板內(nèi)，待細胞長至70%融合時使用NTN1小干擾RNA借助Lip3000進行轉(zhuǎn)染，小干擾RNA序列見表1。用于過表達的慢病毒構(gòu)建體和陰性對照載體，按制造商的說明進行細胞感染。融合度為40%時，RGC-5細胞感染了陰性對照慢病毒（lv-NC，1×109TU/mL）或NTN1慢病毒（lv-NTN1，1×109TU/mL）并與5 μg/mL Polybrene混合。感染24 h后，將細胞置于新鮮培養(yǎng)基中，并用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

1.2.4 RGC-5細胞功能檢測

細胞計數(shù)后接種于96孔板，每孔4 000個細胞，貼壁培養(yǎng)12 h后按不同實驗?zāi)康奶幚?。每組設(shè)5個平行孔，設(shè)對照孔和空白孔，每孔加入CCK-8試劑10 μL，孵育2 h后，在酶標(biāo)儀上測定450 nm處的吸光度。細胞活力=（實驗組吸光度值-空白吸光度值）/（對照組吸光度值-空白吸光度值）×100%，計算出各組細胞活力百分比來反映細胞的增殖能力。使用細胞DNA含量檢測試劑盒及流式細胞儀檢測細胞周期。使用凋亡雙染試劑盒和流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 RT-qPCR檢測NTN1的mRNA表達

在染毒或轉(zhuǎn)染48 h后用TRIzol裂解細胞，按試劑盒提取步驟，提取和純化總RNA并測定濃度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒配制反應(yīng)體系將樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為25 ℃5 min，42℃60 min，70 ℃5 min，4 ℃10 min。根據(jù)試劑盒說明，使用SYBR green配制反應(yīng)體系，在PCR擴增儀上對目的基因NTN1和內(nèi)參基因GAPDH進行擴增。以2-ΔΔCt計算實驗組目的基因相對于對照組目的基因的表達倍數(shù)。實驗重復(fù)3次，取均值。引物序列見表1。

表1 引物及小干擾RNA設(shè)計Table 1 Sequences of PCR Primers and siRNA

1.2.6 Western blot檢測NTN1及ERK信號通路相關(guān)蛋白的表達

在染毒或轉(zhuǎn)染RGC-5細胞48 h后，收集細胞提取總蛋白檢測NTN1、p-ERK和ERK的蛋白表達。將等量的樣品在10%SDS-PAGE凝膠上進行電泳，120 V恒壓電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，室溫5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗膜后二抗常溫孵育90 min，最后使用ECL發(fā)光液，暗室膠片曝光。實驗均重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25.0進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCB1254暴露對RGC-5細胞中NTN1表達水平和ERK通路的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與溶劑對照組（meth組）相比，PCB1254暴露后NTN1 mRNA表達降低（P＜0.05，圖1A）；Western blot結(jié)果顯示，與溶劑對照組（meth組）相比，NTN1及p-ERK的蛋白表達量均降低，當(dāng)PCB1254暴露濃度為2.5 mg/L時，NTN1及p-ERK水平較對照組降低顯著，但總ERK表達量基本不變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在5 mg/L組中差異更明顯（圖1B）。提示PCBs暴露可能通過降低NTN1的表達從而抑制ERK信號分子的磷酸化。

2.2 沉默NTN1對RGC-5細胞功能及ERK信號通路的影響

圖1 PCB1254暴露后對RGC-5細胞中NTN1的表達水平和ERK通路的影響Figure 1 Effects of PCB1254exposure on NTN1 expression level and ERK pathway in RGC-5 cells

采用NTN1小干擾RNA轉(zhuǎn)染細胞，RT-qPCR及Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，沉默組NTN1 mRNA和蛋白表達與對照組（si-NC組）比較均明顯下降，提示轉(zhuǎn)染成功，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A、B）。細胞周期檢測結(jié)果顯示，沉默組S期細胞比例高于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2C），提示NTN1沉默可能使細胞停滯于S期。細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，沉默組與對照組相比無明顯差異（圖2D），提示NTN1沉默對RGC-5細胞的凋亡無明顯影響。CCK-8實驗結(jié)果表明，與si-NC組相比，72 h時沉默組中吸光度值相對倍數(shù)低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2E），提示NTN1沉默抑制了RGC-5細胞的增殖能力。

ERK信號通路蛋白水平檢測結(jié)果顯示，沉默組p-ERK表達下降，而總ERK水平不變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2F），提示NTN1有可能通過ERK信號通路來發(fā)揮作用。

2.3 過表達NTN1對PCB1254暴露后RGC-5細胞功能及ERK信號通路的影響

采用NTN1過表達慢病毒感染細胞，利用RTqPCR及Western blot檢測感染效率，結(jié)果顯示，lv-NTN1組NTN1 mRNA及蛋白表達水平與lv-NC組比較均明顯升高，提示NTN1成功（圖3A、B）。細胞周期實驗結(jié)果顯示，lv-NTN1+PCB組S期細胞比例低于lv-NC+PCB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3C），提示NTN1過表達可以逆轉(zhuǎn)PCB1254對細胞增殖及周期的影響。CCK-8結(jié)果顯示，與空白組（blank）相比，PCB暴露組顯著降低了RGC-5細胞的增殖能力；與lv-NC+PCB組相比，NTN1過表達減輕了PCB1254的毒性作用，提高了RGC-5細胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3D）。本研究進一步利用Western blot方法檢測了各組ERK信號通路蛋白的表達，結(jié)果顯示，lv-NTN1+PCB組較lv-NC+PCB組p-ERK表達升高，而總ERK水平不變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3E），提示NTN1可能通過ERK磷酸化水平調(diào)節(jié)PCBs暴露后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的功能。

3 討論

隨著社會經(jīng)濟和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，受環(huán)境因素、遺傳因素等影響的兒童先天性遺傳性眼病等的發(fā)生率逐步增高。視網(wǎng)膜功能異常與兒童眼病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。任何異常的視覺環(huán)境（包括環(huán)境污染）都可能影響視覺系統(tǒng)的正常發(fā)育，導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能障礙和視力減退［8］。環(huán)境化學(xué)污染物對兒童眼健康危害日益受到重視，弱視兒童血鉛水平顯著高于視力正常兒童；母孕期暴露有機溶劑可導(dǎo)致子代視覺感知障礙［2，8-9］。究其原因：①0～6歲是兒童視網(wǎng)膜發(fā)育和視功能形成的關(guān)鍵時期，②兒童對環(huán)境污染物較成人易感且對污染物耐受性差［10-11］。因此，探索環(huán)境污染物對兒童視網(wǎng)膜發(fā)育的影響和機制，有助于闡明兒童眼病的發(fā)生機制，為兒童眼病的防治提供新思路。

PCBs作為一種常見的環(huán)境污染物，具有毒性高、半揮發(fā)性、長期殘留性等特點，并持續(xù)存在于土壤、水體、空氣及食物（肉類、魚類、母乳）中。盡管PCBs已被禁止生產(chǎn)，但在環(huán)境中仍可以長期存在。在我國，PCBs的污染現(xiàn)狀已不容忽視，大多數(shù)沿海地區(qū)海水中的PCBs濃度均高于國際標(biāo)準(zhǔn)（30 ng/L）［12］；長江入海口表層沉積物中PCBs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為41.65 ng/L［13］。環(huán)境中的PCBs可以通過食物鏈蓄積在生物體中，且可以通過胎盤屏障導(dǎo)致子代暴露，通過原型或其代謝產(chǎn)物發(fā)揮毒性作用?！懊卓酚汀笔录?dǎo)致新生兒眶周水腫、視力下降；美國也曾報道食用PCBs污染的密西根湖魚導(dǎo)致兒童視覺識別記憶功能受損［2，9］。更有研究顯示，即使低水平的PCBs通過胎盤轉(zhuǎn)移到胎兒也可能引起長期的神經(jīng)系統(tǒng)損害［14-15］。本課題組前期研究結(jié)果亦證實，胚胎期斑馬魚暴露PCBs后導(dǎo)致斑馬魚幼魚視網(wǎng)膜厚度增加，細胞排列紊亂，細胞數(shù)量減少，且會導(dǎo)致幼年期斑馬魚視動反應(yīng)行為異常［3-4］；PCBs暴露會減慢RGC-5的增殖和分裂，誘導(dǎo)RGC-5凋亡［16］。因此，深入研究胚胎期PCBs暴露與子代視網(wǎng)膜發(fā)育的機制研究已十分必要。

文獻表明，醋酸鉛可致大鼠腦組織中神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）表達異常［17］。低濃度甲醛可致大鼠肺和腦中NGF表達量顯著上調(diào)，而高濃度甲醛作用下大鼠肺和腦中NGF表達量反而下降［18］。PCB處理的大鼠海馬中緊密連接蛋白和BDNF減少［19］，提示化學(xué)污染物會導(dǎo)致神經(jīng)生長因子表達異常。本研究結(jié)果亦表明，2.5 mg/L以下濃度PCBs暴露后NTN1表達下調(diào)。NTN1作為Netrin家族的一員，是最早發(fā)現(xiàn)的可溶性神經(jīng)導(dǎo)向因子之一，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中為神經(jīng)元和軸突的靶向遷移提供信號。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，NTN1可刺激神經(jīng)元和神經(jīng)軸突的生長和定位，引導(dǎo)神經(jīng)元和軸突到達靶體，對胚胎發(fā)育過程中細胞增殖、遷移、形態(tài)發(fā)生和血管新生等功能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。眼中NTN1主要在視杯中表達，其蛋白定位在胞外，功能域是“NTR”。文獻表明，在視覺系統(tǒng)中，NTN1在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的軸突生長和靶區(qū)分支中起關(guān)鍵作用，NTN1可以影響視覺電路的形成，在功能性視覺系統(tǒng)發(fā)展的關(guān)鍵階段以多種方式塑造突觸前和突觸后樹突的形態(tài)［20］；NTN1基因可通過介導(dǎo)視神經(jīng)乳頭，與視神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)［7］；NTN1基因缺失會造成視神經(jīng)乳頭發(fā)育不良，細胞減少，視杯發(fā)育不全［6］。通過小干擾RNA過表達慢病毒感染RGC-5細胞使得NTN1沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的增殖能力受到抑制，細胞周期停滯于S期，這一結(jié)果與本課題組前期研究PCBs對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損傷作用基本一致，提示NTN1作為一種神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子可能參與調(diào)控PCBs暴露導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的發(fā)育異常。

已有研究報道NTN1對MAPK信號通路有影響，MAPK通路有4種主要的分支路線：ERK、JNK、p38/MAPK和ERK5。本研究組在前期實驗中檢測了PCBs暴露后MAPK明星通路的主要分子表達水平，ERK信號通路的差異結(jié)果一致性較好。ERK是MAPK信號通路中的一員，通過磷酸化多種底物蛋白來調(diào)節(jié)細胞多種生理過程，如細胞的生長、分裂、增殖、凋亡等。因此，本研究選擇ERK信號通路作為進一步研究的對象。NTN1可以通過調(diào)控ERK信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用［21］。NTN1激活ERK信號通路減弱了缺氧-葡萄糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)的細胞死亡和神經(jīng)元凋亡，保護神經(jīng)元免受腦卒中誘導(dǎo)的細胞凋亡［22］；NTN1還可以通過激活高糖處理的角膜上皮細胞中ERK和EGFR的磷酸化，調(diào)節(jié)糖尿病小鼠神經(jīng)纖維再生［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，PCBs暴露和NTN1沉默可以降低ERK磷酸化水平，抑制細胞增殖能力，使細胞周期停滯在S期，而NTN1過表達增加了PCBs暴露后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的磷酸化ERK的表達，恢復(fù)了細胞增殖能力，使S期細胞比例減少，提示NTN1過表達可以緩解PCBs對視網(wǎng)膜發(fā)育的毒性作用。

本研究探討了NTN1在PCBs暴露致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育異常中的作用，但調(diào)控機制的研究尚淺，仍需進一步在動物水平深入研究。