朱 燕，朱永祺，張曉娟*，錢金鋒，劉宏斌，盛美紅

1南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226001；2南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇 南通 226001；3南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院影像科，江蘇 南通 226001

乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌患者預(yù)后的重要因素，研究乳腺癌組織侵襲轉(zhuǎn)移情況，尋求新的靶向治療手段，對于改善乳腺癌患者的預(yù)后具有非常重要的意義。研究表明，惡性腫瘤的生物學(xué)行為不僅取決于腫瘤細(xì)胞本身，腫瘤微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生發(fā)展也起著決定性作用。腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblast，CAF）是腫瘤微環(huán)境中重要的成分，它分泌多種信號分子，包括炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子等，這些因子通過改變腫瘤微環(huán)境來刺激腫瘤細(xì)胞，同時(shí)重塑腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)［1-2］。正是這些特性，CAF通過促進(jìn)腫瘤生長、血管生成、耐藥性、侵襲和轉(zhuǎn)移，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了合適的條件［3］。盡管CAF可能對乳腺癌的進(jìn)展起到很強(qiáng)的作用，但關(guān)于CAF、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，尤其對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響的相關(guān)研究甚少。

本文通過檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中CAF［以CAF的特異性蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）作為免疫酶標(biāo)的抗原］及CD4、CD8的表達(dá)，并結(jié)合臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而探尋CAF誘導(dǎo)的免疫抑制與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度之間的相關(guān)性，進(jìn)一步了解CAF、CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞是否參與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，為用CAF和免疫細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療來改善未來乳腺癌患者的生存及預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象

收集南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科2010—2014年行乳腺癌改良根治術(shù)的手術(shù)標(biāo)本110例（均為浸潤性導(dǎo)管癌），術(shù)前未經(jīng)過任何放療、化療及內(nèi)分泌治療，所有患者均為女性，發(fā)病年齡32～79歲，平均年齡51歲。按照腫瘤大小分組：腫瘤≤2 cm 64例，腫瘤＞2 cm 46例；按照WHO的浸潤性導(dǎo)管癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)［4］分類：G1級32例，G2級43例，G3級35例；按照TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)［4］進(jìn)行分期：Ⅰ期+Ⅱ期89例，Ⅲ期+Ⅳ期21例；按照有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分組：淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移67例；淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移43例。其中43例有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中有11例為微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，32例為宏轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（腫瘤轉(zhuǎn)移灶最大徑＞0.2 mm，但不超過2 mm為微轉(zhuǎn)移；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶最大徑＞2 mm，則為宏轉(zhuǎn)移）。選取乳腺癌癌旁3 cm外的正常乳腺組織作為對照。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色

所有手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋及4 μm連續(xù)切片。鼠抗人α-SMA抗體、兔抗人CD4抗體、兔抗人CD8抗體均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用已知的陽性切片作為陽性對照，陰性對照用PBS液代替一抗。

1.2.2 結(jié)果判定

α-SMA陽性的細(xì)胞定位于乳腺間質(zhì)內(nèi)，胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色，正常乳腺間質(zhì)成纖維細(xì)胞不表達(dá)α-SMA，因此以乳腺間質(zhì)中α-SMA陽性細(xì)胞代表CAF，而表達(dá)α-SMA的乳腺導(dǎo)管及腺體基底部的肌上皮細(xì)胞及間質(zhì)小血管不計(jì)為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×400）約200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞所占觀察細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)分：1分（陽性細(xì)胞數(shù)≤10%），2分（10%＜陽性細(xì)胞數(shù)≤50%），3分（50%＜陽性細(xì)胞數(shù)≤75%），4分（75%＜陽性細(xì)胞數(shù)）；染色強(qiáng)度的評分：0分（無著色），1分（淡黃色），2分（棕黃色），3分（棕褐色）。將兩者分值相乘：0～3分（-），4～5分（+），6～7分（++），≥8分（+++），其中+～+++為陽性表達(dá)。CD4、CD8陽性表達(dá)定位于淋巴細(xì)胞膜，觀察顯色強(qiáng)度：無顯色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；觀察顯色面積：進(jìn)行視野淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，＜5%淋巴細(xì)胞著色計(jì)0分，5%～25%淋巴細(xì)胞著色計(jì)1分，25%～50%淋巴細(xì)胞著色計(jì)2分，＞50%淋巴細(xì)胞著色計(jì)3分；將兩者分值相乘：＜2分為陰性，≥2分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)分析均在SPSS 21.0軟件上進(jìn)行。采用卡方檢驗(yàn)對α-SMA、CD4、CD8在不同亞組患者之間的表達(dá)差異進(jìn)行比較。采用配對樣本卡方檢驗(yàn)對α-SMA表達(dá)與CD4、CD8表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-SMA、CD4及CD8在浸潤性導(dǎo)管癌組織與癌旁組織中的表達(dá)及意義

α-SMA陽性表達(dá)定位在腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞漿中（圖1），110例乳腺癌中有52例（47.27%）呈陽性表達(dá)，其中8例呈強(qiáng)陽性；癌旁正常乳腺組織未見陽性表達(dá)。α-SMA在乳腺癌組織中的陽性率顯著高于癌旁正常乳腺組織，兩者之間的α-SMA表達(dá)有顯著性差異（χ2=68.095，P＜0.001）。

圖1 α-SMA在正常乳腺組織、浸潤性導(dǎo)管癌、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移及宏轉(zhuǎn)移中的表達(dá)（×400）Figure 1 Expresssion of α-SMA in normal breast tissue，invasive ductal carcinoma，lymph node micrometastasis，lymph node macrometastasis（×400）

CD4、CD8陽性表達(dá)定位于淋巴細(xì)胞膜（圖2），CD4+T淋巴細(xì)胞在乳腺癌中陽性率為45.45%（50/110），低于癌旁正常乳腺組織（48.18%，53/110），兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.164，P=0.685）。CD8+T淋巴細(xì)胞在乳腺癌中陽性率為55.45%（61/110），高于癌旁正常乳腺組織（31.82%，35/110），兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.493，P＜0.001）。

2.2 α-SMA、CD4及CD8在浸潤性導(dǎo)管癌組織的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 CD4、CD8在浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)（×400）Figure 2 Expression of CD4 and CD8 in invasive ductal carcinoma（×400）

表1 α-SMA、CD4、CD8在不同亞組患者之間的表達(dá)差異Table 1 α-SMA，CD4 and CD8 expresssion differences among different subgroups ［n（%）］

由表1可見浸潤性導(dǎo)管癌中α-SMA的陽性表達(dá)與年齡、組織學(xué)分級無關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤大小、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）；即腫瘤越大、臨床分期越高、有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中α-SMA的陽性表達(dá)越高；腋窩淋巴結(jié)宏轉(zhuǎn)移所有病例均見α-SMA的表達(dá)。CD4的陽性表達(dá)與年齡、腫瘤大小及臨床分期無關(guān)（P＞0.05），而與組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），CD4的陽性表達(dá)在淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移、微轉(zhuǎn)移、宏轉(zhuǎn)移3組之間的差異處于臨界值（P=0.057），但無轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組（微轉(zhuǎn)移+宏轉(zhuǎn)移）比較時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.736，P＜0.05），即隨著腫瘤組織學(xué)級別的升高、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，CD4的陽性率逐漸降低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分組中宏轉(zhuǎn)移組表達(dá)率最低。CD8的陽性表達(dá)與年齡、腫瘤大小及臨床分期無關(guān)（P＞0.05），而與組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05）；即隨著腫瘤組織學(xué)級別的升高、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，CD8的陽性率逐漸升高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分組中宏轉(zhuǎn)移表達(dá)率最高。

2.3 浸潤性導(dǎo)管癌中α-SMA表達(dá)與CD4、CD8表達(dá)的相關(guān)性分析

浸潤性導(dǎo)管癌中α-SMA染色陽性52例（52/110，47.27%），其中CD4陽性15例（15/52，28.85%），CD8陽性41例（41/52，78.85%）；α-SMA陰性58例（58/110，52.73%），其中CD4陽性35例（35/58，60.34%），CD8陽性20例（20/58，34.48%）。經(jīng)配對計(jì)數(shù)資料的相關(guān)分析（表2），浸潤性導(dǎo)管癌中α-SMA陽性表達(dá)與CD8的陽性表達(dá)存在正相關(guān)性（C=0.446，P＜0.001），與CD4的陽性表達(dá)存在負(fù)相關(guān)（C=-0.316，P=0.001）。

表2 α-SMA與CD4、CD8表達(dá)的相關(guān)性Table 2 Correlation between α -SMA and CD4，CD8 expresssion （n）

3 討論

研究表明，惡性腫瘤的生物學(xué)行為不僅取決于腫瘤細(xì)胞本身，腫瘤微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生發(fā)展也起著決定性的作用。腫瘤微環(huán)境由細(xì)胞外基質(zhì)和各種腫瘤間質(zhì)細(xì)胞（包括成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨髓來源細(xì)胞）組成。其中CAF是最豐富的腫瘤間質(zhì)細(xì)胞，目前已經(jīng)被證實(shí)在許多癌癥的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［5-7］。CAF通過分泌許多活性蛋白質(zhì)因子促進(jìn)了癌細(xì)胞的活化與增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成、腫瘤基質(zhì)的重塑間接促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)，CAF還能利用自身分泌的蛋白質(zhì)因子如TGF-β、IL-6、IL-10等促使癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化并促使MMP2、MMP9等相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞的發(fā)生，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［8］?；仡櫸墨I(xiàn)發(fā)現(xiàn)對CAF介導(dǎo)的免疫抑制與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度的相關(guān)性報(bào)道極少見。

本文以浸潤性導(dǎo)管癌中的CAF（以CAF的特異性蛋白α-SMA作為免疫酶標(biāo)的抗原）及腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞（CD4+、CD8+）為切入點(diǎn)，探討這兩種因素與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。當(dāng)腫瘤組織中浸潤大量淋巴細(xì)胞時(shí)表明機(jī)體啟動(dòng)了對抗腫瘤的反應(yīng)，CD4+T淋巴細(xì)胞可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖及分化，協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞間的相關(guān)作用［9］，CD8+T淋巴細(xì)胞是主要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，通過釋放穿孔素或者促進(jìn)細(xì)胞凋亡來殺死腫瘤細(xì)胞［10］，是有效控制腫瘤發(fā)展，提高腫瘤患者治療效果的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。

本組資料顯示，α-SMA在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常乳腺組織，且腫瘤較大、臨床分期較高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中α-SMA的表達(dá)較高，提示CAF通過各種機(jī)制影響腫瘤微環(huán)境而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究顯示α-SMA在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)宏轉(zhuǎn)移中表達(dá)逐漸升高，從而可判斷CAF具有促進(jìn)癌細(xì)胞在淋巴結(jié)中存活、增殖的作用。CD4在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)低于癌旁正常乳腺組織，且隨著腫瘤組織學(xué)級別的升高、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，CD4的陽性率逐漸降低。CD8在乳腺癌組織中的陽性率高于癌旁正常乳腺組織，且隨著腫瘤組織學(xué)級別的升高、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，CD8的陽性率逐漸升高，此研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11-13］。原因可能為腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制因子，抑制免疫細(xì)胞分化增殖而導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞減少，CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)性增多。隨著腫瘤的進(jìn)展，產(chǎn)生和分泌的抑制因子會(huì)越來越多，誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的同時(shí)也阻止CD4+T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。進(jìn)一步分析顯示，CD4在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)宏轉(zhuǎn)移中陽性率逐漸降低，而CD8的陽性率則相反，表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者細(xì)胞免疫明顯受到抑制，隨著疾病的進(jìn)展，機(jī)體免疫功能逐漸降低，從而造成腫瘤細(xì)胞加速生長，病情出現(xiàn)惡化。經(jīng)配對計(jì)數(shù)資料的相關(guān)分析，乳腺癌中α-SMA表達(dá)與CD8的陽性表達(dá)存在正相關(guān)性（C=0.446，P＜0.001），與CD4的陽性表達(dá)存在負(fù)相關(guān)（C=-0.316，P=0.001）。可能與CAF通過旁分泌或自分泌TGF-β進(jìn)而引起一系列細(xì)胞因子IL-10等的表達(dá)，抑制淋巴細(xì)胞分化增殖有關(guān)；TGF-β還可抑制NK細(xì)胞合成γ-干擾素并阻礙CD4+Th細(xì)胞向具有抗腫瘤免疫活性的Th1方向分化，導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能處于抑制狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，進(jìn)一步促進(jìn)癌腫的生長和侵襲轉(zhuǎn)移［14-15］。α-SMA表達(dá)與CD4、CD8表達(dá)密切相關(guān)，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是多級因子相互作用的復(fù)雜過程。α-SMA及CD8的表達(dá)在乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)明顯增多，且與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度有關(guān)，即CAF及免疫細(xì)胞的改變增強(qiáng)了乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究為進(jìn)一步用CAF和免疫細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療來改善未來乳腺癌患者的生存及預(yù)后提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。