趙彥華，史楊白，劉國(guó)興，薛暉

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）是一種革蘭氏陽(yáng)性桿菌，屬微生物源殺蟲(chóng)劑，以胃毒作用為主[1]。其中蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp.israelensis, Bti）是一種對(duì)蚊幼蟲(chóng)具有毒殺作用的病原微生物，主要作用成分是芽孢形成過(guò)程中合成的具有特異殺蟲(chóng)活性的毒素蛋白[2]。它同蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、人畜病原菌炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）、蕈狀芽孢桿菌（B.mycoides）、韋氏芽孢桿菌（B.weihenstephanensis）組成芽孢桿菌屬蠟狀芽孢桿菌組（B.cereus group），它們的形態(tài)特征、生理生化特征非常相似，并有著極高的DNA 同源性[3]。

在沙塘鱧養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展過(guò)程中，養(yǎng)殖環(huán)境中大量細(xì)菌的分布及沙塘鱧種質(zhì)資源的退化，導(dǎo)致沙塘鱧的病害日趨嚴(yán)重。近年來(lái)，在沙塘鱧養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)如鰓部及頭部潰爛，腸道出血，體表有出血點(diǎn)等病害現(xiàn)象，但目前針對(duì)養(yǎng)殖沙塘鱧病害的研究及防控均處于初級(jí)階段，針對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程中的病害死亡原因，無(wú)統(tǒng)一定論?，F(xiàn)對(duì)養(yǎng)殖沙塘鱧內(nèi)臟細(xì)菌進(jìn)行分離，在腸道內(nèi)獲得一株溶血性蘇云金芽孢桿菌，并進(jìn)行一系列研究，以期為沙塘鱧養(yǎng)殖病害提供防治參考。

1 研究方法

1.1 材料

沙塘鱧取自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所沙塘鱧養(yǎng)殖基地，魚(yú)體大小約8～11 cm，體質(zhì)量約為25～30 g。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 取沙塘鱧，用75%酒精消毒體表后，按照無(wú)菌操作的方法，用滅菌手術(shù)剪剪開(kāi)其頭部及腹部，分別取肝臟及腸道，勻漿后接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上。28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢(shì)菌，編號(hào)為SCYB2019 并進(jìn)行分離純化、保種。

1.2.2 分離菌鑒定 選取典型菌落，分離純化后進(jìn)行常規(guī)生理生化特征檢驗(yàn)，檢驗(yàn)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[4]進(jìn)行常規(guī)生化指標(biāo)鑒定。生理生化指標(biāo)采用API/ATB 半自動(dòng)化細(xì)菌分析儀鑒定，將分離純化的菌落混于生理鹽水中，濃度為0.5 mol/L McFarland。吸取菌懸液接種ID32E 測(cè)試卡，每孔接種55 μL，置于35 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h。取出置于分析儀閱讀器上檢測(cè)反應(yīng)，得出編碼，轉(zhuǎn)化判定結(jié)果。

1.2.3 溶血性試驗(yàn) 將菌株SCYB2019 接種于4%綿羊血平板，綿羊血平板購(gòu)自環(huán)凱生物科技有限公司，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察其溶血性。

1.2.4 細(xì)菌16 S rDNA 的鑒定 將分離純化后菌株SCYB2019，用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增于上海生工有限公司測(cè)定細(xì)菌的16 S rDNA 序列，將所得菌株16 S rDNA 序列輸入GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，同時(shí)從GenBank 中下載芽孢桿菌屬多個(gè)序列，利用MEGA4.1 軟件包進(jìn)行序列比對(duì)，并采用鄰接法（Neighbor-Joining method）分析同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌菌落特征

沙塘鱧肝臟勻漿后涂布的培養(yǎng)基中未見(jiàn)有細(xì)菌長(zhǎng)出，而在腸道涂布的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中可見(jiàn)大量形態(tài)特征均一致的圓形菌落，菌落邊緣呈鋸齒狀，表面粗糙呈白蠟狀，經(jīng)革蘭氏染色，在顯微鏡的油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，革蘭氏染色陽(yáng)性，細(xì)菌呈桿狀，紫色，以短鏈或長(zhǎng)鏈分布，無(wú)莢膜，具運(yùn)動(dòng)性（圖1）。

圖1 SCYB2019 菌落特征及革蘭氏染色

2.2 分離菌的生理生化特征

生理生化特征經(jīng)API/ATB 半自動(dòng)化細(xì)菌分析儀鑒定，表明菌株SCYB2019 隸屬于芽孢桿菌屬Bacillus sp.（表1）。

2.3 分離菌溶血性分析

在綿羊血平板上，菌落呈淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，菌落周?chē)霈F(xiàn)溶血環(huán)，見(jiàn)圖2。

表1 SCYB2019 生理生化特征①

圖2 SCYB2019 溶血活性

2.4 細(xì)菌的16 S rDNA 序列分析

菌株SCYB2019 的16 S rDNA 大小為1 480 bp，輸入GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示與蘇云金芽孢桿菌序列具有100%的覆蓋率和100%的同一性。采用鄰接法構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，從發(fā)育樹(shù)中可以看出SCYB2019 與蘇云金芽孢桿菌同源性達(dá)到90%以上，同時(shí)結(jié)合生理生化特征，鑒定菌株SCYB2019 為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），

3 討論

圖3 以16S rDNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

沙塘鱧屬魚(yú)類(lèi)分布于中國(guó)境內(nèi)共有4 種，即河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧、海豐沙塘鱧（O.haifengensis）、中華沙塘鱧（O.sinensis）[5]。沙塘鱧（Odontobutis obscurus）又名河川沙塘鱧，還有烏草包、土布魚(yú)等稱(chēng)謂，是鱸形目、塘鱧科、沙塘鱧屬的魚(yú)類(lèi)，一般分布在我國(guó)長(zhǎng)江水系中下游、閩江等水系中[6]。因其刺少肉多，肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，所含人體必需的氨基酸比一般魚(yú)類(lèi)高等特點(diǎn)，故在江浙地區(qū)廣受歡迎。河川沙塘鱧分布較廣且自然資源量豐富，但個(gè)體較小，繁育周期長(zhǎng)且不易被馴化吃飼料[7]。近些年，隨著野生資源的急劇衰退和市場(chǎng)需求的不斷增長(zhǎng)，河川沙塘鱧已發(fā)展成為一個(gè)非常具有潛力的水產(chǎn)養(yǎng)殖新品種[8]。目前全國(guó)已經(jīng)零星開(kāi)展了沙塘鱧的混養(yǎng)和套養(yǎng)，但產(chǎn)量還遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的消費(fèi)需求[9]。

近年來(lái)，蠟狀芽孢桿菌被認(rèn)為是一種有益的微生物，開(kāi)始用作益生素添加到食品和飼料中，部分菌株還作為植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用[10]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，也廣泛開(kāi)始使用蠟狀芽孢桿菌制劑，不僅僅可以改善養(yǎng)殖水體富營(yíng)養(yǎng)化，其代謝產(chǎn)物能夠抑制病原菌和有害藻類(lèi)生長(zhǎng)，而蘇云金芽孢桿菌與蠟狀芽孢桿菌的區(qū)別在于蘇云金芽孢桿菌攜帶殺蟲(chóng)質(zhì)粒，能夠編碼形成芽孢孢外膜外的伴胞晶體，這使得蠟狀芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌之間可相互轉(zhuǎn)化[11]。目前，有學(xué)者鑒于蘇云金芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌基因組的高度同源性，認(rèn)為蘇云金芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌應(yīng)歸為同一個(gè)種[12]，該次試驗(yàn)通過(guò)傳統(tǒng)的16 S rDNA 分析，得到了分離到的細(xì)菌為蘇云金芽孢桿菌的結(jié)論。

在養(yǎng)殖沙塘鱧腸道內(nèi)的蘇云金芽孢桿菌，極有可能是在使用含有蠟狀芽孢桿菌的微生物制劑的過(guò)程中，蠟狀芽孢桿菌轉(zhuǎn)化為蘇云金芽孢桿菌，而蘇云金芽孢桿菌本身就攜帶腸毒素基因，能夠造成養(yǎng)殖品種的病害。李丹蕾等[13]的研究表明，蘇云金芽孢桿菌能夠造成健康凡納濱對(duì)蝦死亡，并且表現(xiàn)出肝胰腺壞死的癥狀。這就要求在養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)用含有蠟狀芽孢桿菌的微生態(tài)制劑時(shí)，有必要對(duì)這些菌株安全性進(jìn)行系統(tǒng)的分析和評(píng)價(jià)。