張鵬 余翔 陳卓峰 任輝 沈耿楊 張志達 尚奇 梁德 江曉兵,4*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510405 3.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 523808 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種系統(tǒng)性骨病，常引起骨折等嚴重并發(fā)癥[1]。OP在中醫(yī)學(xué)里面屬于“骨痿”等范疇，其主要病機為腎精不足，骨失滋養(yǎng)[2]。以脊柱變形、全身骨骼疼痛、易出現(xiàn)骨折為主要臨床表現(xiàn)[3]。OP與年齡密切相關(guān)[4-5]，據(jù)統(tǒng)計，2016年我國60歲以上的老年人中超過三分之一患有OP，其中男性約占25 %，女性接近50 %[6]，OP危害老年人的生命健康，增添家庭、社會的負擔。抑制骨吸收藥物是臨床治療OP的主要藥物[7]，但這些藥物因使用過程中存在一些并發(fā)癥從而限制了其臨床運用[8]。目前，中醫(yī)藥治療OP的療效逐漸被患者所認可，引起了當今國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[9-10]。

作為骨碎補中含量最豐富的一種黃酮類活性分子，柚皮苷(naringin，NR)具備補腎強骨等療效[11]，在臨床上有較好的實際運用和發(fā)展前景。目前研究顯示NR能促進成骨細胞的增殖[12]，也可通過誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的表達，促進成骨分化[13]。但是，NR治療OP涉及靶點通路眾多，起效機制復(fù)雜，傳統(tǒng)藥理學(xué)難以進行系統(tǒng)的分析。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的新興和發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為研究潛在分子機制的新方法，更系統(tǒng)綜合地分析活性分子對疾病治療的起效機制，與活性分子多靶點、多途徑干預(yù)疾病的治療原理相契合[14]。本文擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探究NR治療OP的潛在作用機制，為其提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 獲取NR結(jié)構(gòu)及靶點信息

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)獲取NR結(jié)構(gòu)及其靶點信息，同時通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取NR的三維結(jié)構(gòu)(以SDF格式儲存)，并將所得到的NR三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://new.swisstargetprediction.ch/)獲得NR的相關(guān)靶點，然后將TCMSP數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫得到的靶點去重合并得到NR的靶點。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的人源基因名。

1.2 OP靶點集的獲取及NR治療OP的潛在作用靶點預(yù)測

檢索GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://www.omim.org)數(shù)據(jù)庫獲得OP對應(yīng)靶點。利用R軟件，將OP靶點與 1.1 中靶點進行映射，得到兩者交集靶點。

1.3 建立NR治療OP的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

在STRING 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中導(dǎo)入交集靶點，隱藏孤立蛋白后得到蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)信息，并將其輸入到Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)軟件建立PPI網(wǎng)絡(luò)，同時進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，將網(wǎng)絡(luò)中高于度值(degree)平均值的靶點蛋白篩選出來作為核心靶點。

1.4 NR治療OP網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

建立柚皮苷交集靶點與骨質(zhì)疏松的對應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2 軟件中繪制NR治療OP網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO功能富集分析

使用 R 軟件及其程序包對交集靶點進行GO功能富集分析，pvalue Cutoff、qvalue Cutoff均設(shè)為0.05，將每類顯著性排在前20的富集結(jié)果以點狀圖的形式進行展示。此外，將交集靶點輸入至 Cytoscape 3.7.2 軟件中進行GO功能富集分析，將主要與疾病相關(guān)的生物學(xué)過程或功能篩選出來(P< 0.05)，最后將交集靶點及上述生物學(xué)過程或功能進行可視化展示。

1.6 KEGG通路富集分析

同樣通過 R 軟件及其程序包對交集靶點進行 KEGG分析，pvalue Cutoff、qvalue Cutoff均設(shè)為0.05，按照顯著性進行排序，將富集得到的信號通路(P< 0.05)進行展示，并運用Cytoscape 3.7.2軟件繪制NR治療OP的“通路-靶標”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 NR結(jié)構(gòu)及其靶點信息

通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫檢索去重后得到105個作用靶點。NR結(jié)構(gòu)相關(guān)信息詳見表 1，105個作用靶點詳見表 2。

表1 柚皮苷的結(jié)構(gòu)Table 1 The structure of naringin

2.2 NR治療OP的潛在作用靶點預(yù)測

共獲得OP相關(guān)靶點 3 261個，與2.1中得到的105個NR靶點進行映射，得到交集靶點 44個，見圖1。NR治療OP的潛在作用靶點見表3。

圖1 柚皮苷-骨質(zhì)疏松癥交集靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of naringin-osteoporosis intersection targets

表3 柚皮苷治療骨質(zhì)疏松潛在作用靶點基因

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)

將STRING 數(shù)據(jù)庫得到的PPI信息輸入到 Cytoscape 3.7.2 軟件制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共涉及41個節(jié)點，161條邊，詳見圖2。 該網(wǎng)絡(luò)中超過度值平均值(7.85)的靶點蛋白有18個，視其為核心靶點，意味著它們很有可能是NR對OP起治療作用的關(guān)鍵。核心靶點信息詳見表4。

圖2 潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network of potential targets

表4 柚皮苷治療骨質(zhì)疏松網(wǎng)絡(luò)核心靶點

2.4 NR治療OP網(wǎng)絡(luò)圖

構(gòu)建“柚皮苷-交集靶點-骨質(zhì)疏松”的對應(yīng)關(guān)系，將其輸入 Cytoscape 3.7.2 軟件中，得到NR治療OP網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)由46個節(jié)點(其中 1 個NR節(jié)點，44個靶點，1 個OP節(jié)點)和88條邊組成。網(wǎng)絡(luò)圖中藍色菱形節(jié)點代表靶點，紅色多邊形節(jié)點代表“柚皮苷”，橙色橢圓形節(jié)點代表“骨質(zhì)疏松癥”，線條代表柚皮苷、骨質(zhì)疏松癥與靶點具有對應(yīng)關(guān)系，見圖3。

圖3 柚皮苷-交集靶標-骨質(zhì)疏松網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Naringin-intersection target-osteoporosis network diagram

2.5 GO功能富集分析

使用R軟件進行GO生物過程(GO BP)富集分析，共獲得533個結(jié)果，主要涉及類固醇激素反應(yīng)、固有凋亡信號通路、激素分解代謝過程、腺體發(fā)育、氧化應(yīng)激反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等；GO細胞組成(GO CC)富集分析共獲得3個結(jié)果，涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)；GO分子功能(GO MF)富集分析共獲得71個結(jié)果，主要涉及雌激素受體結(jié)合、肽鏈內(nèi)切酶、跨膜轉(zhuǎn)運蛋白、核受體、轉(zhuǎn)錄因子的活性等方面。GO BP、GO CC、GO MF富集分析結(jié)果見圖4～圖6。此外，將 44個靶點導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2 進行GO富集分析，結(jié)果主要涉及①炎癥相關(guān)的，如調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等；②細胞周期相關(guān)的，如調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、衰老、凋亡；③激素代謝相關(guān)的，如雄激素代謝過程，雌激素受體結(jié)合等。詳見圖7。

圖4 GO BP富集分析結(jié)果Fig.4 GO BP enrichment analysis results

圖5 GO CC富集分析結(jié)果Fig.5 GO CC enrichment analysis results

圖6 GO MF富集分析結(jié)果Fig.6 GO MF enrichment analysis results

圖7 篩選后的GO富集分析圖Fig.7 GO enrichment analysis after screening

2.6 KEGG分析

使用R軟件對44個靶點進行KEGG分析。共得到 43個結(jié)果，相關(guān)信號通路共有11條，詳見表5，運用Cytoscape 3.7.2進行網(wǎng)絡(luò)可視化，詳見圖8，圖中粉紅色三角形節(jié)點代表信號通路，藍色橢圓形節(jié)點代表基因，線條代表通路與基因之間的對應(yīng)關(guān)系。

3 討論

3.1 靶標與PPI網(wǎng)絡(luò)分析

柚皮苷是中藥骨碎補中活性成分含量最豐富的一類黃酮類化合物，同時也存在于柑橘類水果和許多中藥里面[15]?，F(xiàn)有研究表明黃酮類化合物可通過雌激素受體介導(dǎo)、OPG/RANK/RANKL、酶抑制作用、調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等機制預(yù)防OP[16]。

表5 KEGG通路富集結(jié)果Table 5 KEGG pathway enrichment analysis results

圖8 “通路-靶標”網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Pathway-target network

通過靶點預(yù)測得到柚皮苷作用于骨質(zhì)疏松的靶點共44個，經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選后的核心靶標共有18個，主要有 TNF、CASP3、ESR1、CDKN1A等，PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)特征以炎癥反應(yīng)、細胞周期調(diào)節(jié)以及激素代謝相關(guān)的蛋白居多，與GO富集分析結(jié)果相互印證。其中TNF的度值遠高于其他核心靶點，推測TNF是柚皮苷治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵靶點。TNF(腫瘤壞死因子)，通稱為TNF-α，是一種炎癥反應(yīng)相關(guān)的重要因子，可誘導(dǎo)巨細胞集落刺激因子(macro-phagecolony-stimulating factor，M-CSF)的表達，可通過激活NF-kB啟動RANKL(NF-κB受體激活因子配體)誘導(dǎo)的破骨細胞生成，加速骨吸收發(fā)展進程，為骨質(zhì)疏松癥的上調(diào)基因[17-18]。因此，筆者推測柚皮苷可以通過下調(diào)骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)TNF-α水平，下調(diào)RANKL的表達，減少破骨細胞的生成，起到防治OP的目的。CASP3(半胱氨酸蛋白酶3)是度值排列第二的靶標，影響細胞凋亡過程[19]。有研究通過實驗證明CASP3 mRNA表達上調(diào)對治療OP有促進作用[20]。進一步的研究表明CASP3的上調(diào)可以激活p53信號通路破壞成骨細胞成熟并抑制軟骨細胞分化[21]。ESR1(雌激素受體)是度值排列第三的靶標，與骨形成代謝等具有密切關(guān)系，ESR1與雌激素結(jié)合后，可通過調(diào)節(jié)細胞因子，影響相關(guān)信號通路，調(diào)控軟骨內(nèi)成骨的過程，對軟骨厚度的維持、骨生長平衡有促進作用[22]。絕經(jīng)后婦女出現(xiàn)骨質(zhì)疏松是由于體內(nèi)缺乏雌激素，致使骨量丟失加速，甚至引發(fā)骨折，而ESR1是雌激素在細胞內(nèi)發(fā)揮生理活性的作用靶點，主要表現(xiàn)在細胞的生長分化、衰老凋亡，由此可見ESR1與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松密切相關(guān)[23]。CDKN1A(細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1 A)，又稱為p21，能夠調(diào)控細胞的增值、分化和衰老[24]。成骨細胞數(shù)量與細胞增殖密切相關(guān)[25]，而細胞增殖周期的進程主要受到G1期調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控[26]。CDKN1A(p21)，作為G1期調(diào)節(jié)蛋白，能結(jié)合細胞周期素與細胞周期蛋白依賴激酶形成的復(fù)合體，使其失活[27]，導(dǎo)致細胞周期停滯于G1期[28]。吳銀生等[29]研究發(fā)現(xiàn)，第3腰椎成骨細胞p21蛋白含量在大鼠去卵巢4、8、12、18、24周顯著升高(P<0. 01)。易顯富等[30]研究發(fā)現(xiàn)p21蛋白表達的下調(diào)可促進成骨細胞增殖。劉明等[31]研究發(fā)現(xiàn)，新仙靈骨葆膠囊可能通過作用于p21等G1期關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白而影響成骨細胞增殖周期，可治療大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松癥?？梢?，CDKN1A在成骨細胞增殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

此外，表3中PTGS1(COX-1)是限制前列腺素生成的一類酶，而前列腺素可以誘導(dǎo)M-CSF以及RANKL的表達，促進破骨細胞分化，抑制成骨細胞功能[18]。ESR2與ESR1同為雌激素的受體，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松相關(guān)。

故柚皮苷-交集靶標-骨質(zhì)疏松網(wǎng)絡(luò)圖關(guān)聯(lián)復(fù)雜，可見柚皮苷治療骨質(zhì)疏松是通過多靶點多途徑之間的相互作用實現(xiàn)的，并且蘊含著多種潛在的治療作用。

3.2 GO分析和KEGG分析

GO富集分析結(jié)果所反映的內(nèi)容與PPI網(wǎng)絡(luò)規(guī)律相似，與炎癥反應(yīng)、細胞周期調(diào)節(jié)以及激素代謝相關(guān)。而KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示相關(guān)靶點基因富集于p53、IL-17、NF-κB、Estrogen、Prolactin等信號通路，可能是柚皮苷治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵信號通路，KEGG通路富集分析結(jié)果反映的內(nèi)容也與PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析及GO富集分析結(jié)果規(guī)律相似。相關(guān)研究表明，p53信號通路的激活能破壞成骨細胞成熟并抑制軟骨細胞分化[21]。IL-17信號通路能夠通過IL-17刺激單核細胞分化形成破骨細胞，且IL-17可以促進TNF-α的合成，上調(diào)IL-6、NF-κB等細胞因子的表達，促進RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞形成[32]。破骨細胞的激活依賴于RANKL與RANK的結(jié)合，進而活化NF-kB信號通路，促進破骨細胞的分化[33]，通過下調(diào)NF-κB信號通路，能夠抑制破骨細胞分化。由此可見IL-17信號通路、NF-κB信號通路與OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)調(diào)控成骨細胞和破骨細胞的機制密切相關(guān)。據(jù)此推測IL-17信號通路與NF-κB信號通路可能是柚皮苷治療骨質(zhì)疏松癥的重要信號通路。Estrogen(雌激素)信號通路可以匯聚Wnt信號通路、蛋白激酶通路、BMP-2信號通路等共同調(diào)控成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和凋亡[34]。此外Prolactin(泌乳素)信號通路同Estrogen(雌激素)信號通路均表明柚皮苷具有雌激素調(diào)節(jié)作用，是柚皮苷可運用于絕經(jīng)后OP的證據(jù)。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示柚皮苷可能通過多靶點、多通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細胞周期、激素代謝來治療骨質(zhì)疏松。本研究所得結(jié)果與現(xiàn)有的骨質(zhì)疏松研究結(jié)果相吻合，為后續(xù)的柚皮苷藥理機制分析和實驗設(shè)計提供了數(shù)據(jù)支持。