陳華梅 黃楓 申震 林海雄 黃敏玲 李紫閣 李定 吳真 姜自偉

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的全身系統(tǒng)性骨病[1]。隨著年齡的增長(zhǎng)，該病患病率越高[2]，已成為一種慢性多發(fā)常見(jiàn)病[3]，我國(guó)OP的總患病率為13 %[4]，2010年至2016年60歲以上人群OP總體患病率約為36 %[5]；對(duì)于OP的防治，西藥大體有促進(jìn)骨礦化藥、抑制骨吸收藥以及促進(jìn)骨形成藥[6]，但價(jià)格昂貴及不良反應(yīng)[7-8]，部分人難以接受，而“簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)”的中醫(yī)治療不失為一種選擇。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯首創(chuàng)于金代醫(yī)家李東垣，由黃芪、當(dāng)歸組成，兩藥[10]皆為治療OP常用藥；研究[9]表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯能改善小鼠紅細(xì)胞功能，改善小鼠的骨髓抑制并且增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[11]；此外還能保護(hù)心腦血管功能[12]、抗氧化[13]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[14]、改善骨小梁結(jié)構(gòu)[15]、正向調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化[16]。目前國(guó)內(nèi)不乏對(duì)于當(dāng)歸補(bǔ)血湯有效成分的研究[17]，但機(jī)理仍未探清，基于此，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度對(duì)當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療OP的分子機(jī)制進(jìn)行探究，為臨床提供導(dǎo)向。

1 材料和方法

1.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯有效成分、對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)及靶基因的獲取

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取當(dāng)歸補(bǔ)血湯所有化學(xué)成分，根據(jù)OB>30 %、DL>0.18以及HL>4條件篩選出有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)；通過(guò)Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“人”，篩選出對(duì)應(yīng)的靶基因。

1.2 OP對(duì)應(yīng)靶基因獲取

借助GeneCards(https://genealacart.genecards.org)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Osteoporosis”為檢索詞，限定物種為“人”，檢索OP的相關(guān)靶基因。

1.3 “有效化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將獲取的有效化學(xué)成分對(duì)應(yīng)靶基因與獲取的OP相關(guān)靶基因通過(guò)生物信息學(xué)與進(jìn)化基因組學(xué)網(wǎng)站繪制Venn圖，整理有效化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)資料，運(yùn)用Cytoscape 3.5.1軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)資料進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)(node)有疾病、有效成分、有效成分-疾病共同靶基因，邊(edge)代表組分之間聯(lián)系, 并篩選出當(dāng)歸補(bǔ)血湯作用于OP的關(guān)鍵化合物。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

將取得的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)中，限定物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評(píng)分設(shè)置為“highest confidence(0.90)”，隱藏獨(dú)立與其他蛋白無(wú)連接的蛋白，余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖，再借助R軟件統(tǒng)計(jì)分析得到所有蛋白鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目，統(tǒng)計(jì)分析排名前30的靶蛋白。

GO功能分析與KEGG通路富集分析借助R軟件將取得的交集基因轉(zhuǎn)化基因ID，進(jìn)行基因功能、通路富集分析，設(shè)置條件P<0.05，限制物種為“人”，P值越小，富集越顯著，排名越前，統(tǒng)計(jì)分析排名前20的基因功能與通路。

2 結(jié)果

2.1 有效成分、靶基因

篩選出有效化合物黃芪共15個(gè)(除去1個(gè)無(wú)靶點(diǎn)的化合物)，當(dāng)歸2個(gè)，總計(jì)17個(gè)，如下表1示；有效化合物對(duì)應(yīng)靶基因共184個(gè)(重復(fù)基因只留1個(gè))。

2.2 疾病靶基因

獲取OP相關(guān)靶基因3 368個(gè)。

2.3 藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

將步驟1.1中184個(gè)靶基因與步驟1.2中獲取的3 368個(gè)靶基因取交集，如圖1，得出130個(gè)交集基因。利用Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建有效成分-疾病-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，如圖2，共148個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)，其中外圈綠色圓形為130個(gè)靶基因，內(nèi)圈中三角形為17個(gè)有效化合物(其中紫色為黃芪的15個(gè)有效化合物；黃色為當(dāng)歸2個(gè)有效化合物)，兩圈之間紅色菱形為疾病，共423條邊(edge)；根據(jù)MCC算法得出前7個(gè)關(guān)鍵化合物，其中當(dāng)歸2個(gè)，黃芪5個(gè)，如表2。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯候選化合物成分Table 1 Candidate compounds in DGBXD

圖1 藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)Venn圖Fig.1 Venn diagram of drug-disease network

圖2 中藥有效成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of active component-disease-target of traditional Chinese medicine

表 2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療OP核心活性成分

2.4 PPI互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及靶蛋白篩選

將130交集靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得117個(gè)靶蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，如圖3(其中13個(gè)靶蛋白未發(fā)生相互作用)，共880條邊，通過(guò)R軟件統(tǒng)計(jì)分析出的排名前30的靶蛋白，如圖4，其中靶蛋白主要有JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK14、ESR1、MAPK8、FOS、CXCL8、VEGFA。

圖3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療OP靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 OP target proteins PPI network treated with DGBXD

圖4 排名前30的靶蛋白Fig.4 Top 30 target proteins

2.5 GO功能分析

通過(guò)R軟件進(jìn)行基因功能分析得出，130個(gè)交集基因涉及138個(gè)生物過(guò)程，P值越小，排名越前，統(tǒng)計(jì)分析前20生物功能如表3、圖5、圖6，主要涉及核受體活性、 配體轉(zhuǎn)錄因子活性、 調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體活性等功能，涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、白細(xì)胞粘附聚集生物過(guò)程。

圖5 GO功能富集分析Fig.5 Analysis of GO function enrichment

圖6 GO功能分析氣泡圖Fig.6 Bubble chart of GO function analysis

2.6 KEGG通路富集分析

共富集在149條生物信息通路(P<0.05)，排名前20通路如圖7、圖8，主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、乙型肝炎、前列腺癌、TNF信號(hào)通路等通路。

圖7 KEGG富集通路分析Fig.7 Analysis of KEGG pathway enrichment

圖8 KEGG通路氣泡圖Fig.8 Bubble chart of KEGG pathways

3 討論

OP的發(fā)生被認(rèn)為與活性氧(ROS)誘導(dǎo)的體內(nèi)氧化應(yīng)激極其密切[18]，不限于主流的觀點(diǎn)由缺乏雌激素引起[19]；研究[20]表明增齡與氧化應(yīng)激反應(yīng)正相關(guān)，與抗氧化能力負(fù)相關(guān)，提示氧化應(yīng)激與增齡性骨量減少關(guān)系密切；絕經(jīng)后雌激素的缺乏，導(dǎo)致成骨細(xì)胞活性氧增加，抗氧化酶水平降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)活躍，進(jìn)而加快OP進(jìn)程[21]，而激素療法[22]作為防治OP方法，并不能明顯改善OP癥狀。ROS作為氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子，生理情況下，氧化-抗氧化處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[19]；當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激條件時(shí)，ROS可以通過(guò)聯(lián)級(jí)反應(yīng)抑制成骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，降低成骨細(xì)胞功能[23]，使成骨效應(yīng)滯后于破骨，進(jìn)而引發(fā)OP。

從上述所獲7個(gè)關(guān)鍵成分中，槲皮素具有強(qiáng)抗氧化作用[24,27]，能提高超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性，此外還可發(fā)揮抗炎作用[24]；毛蕊異黃酮、芒柄花素可直接清除氧自由基[25]；山奈酚[26]能增加超氧化物歧化酶活性，消除氧自由基，降低ROS含量，從而減輕氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞凋亡；異鼠李素同樣具有強(qiáng)氧自由基清除能力[27]；豆甾醇與β-谷甾醇有天然的氧自由基清除能力，能抑制PGE2表達(dá)發(fā)揮抗炎能力；β-谷甾醇還可發(fā)揮雌激素樣作用[28], 而雌激素能夠刺激成骨細(xì)胞且抑制破骨細(xì)胞的作用；研究[30-31]證明山奈酚有明顯的雌激素作用，可以顯著激活成骨細(xì)胞表面雌激素受體ER的活性，促進(jìn)成骨，改善骨質(zhì)疏松狀態(tài)。雌激素缺乏、氧化應(yīng)激條件下, ROS水平上升，可將Wnt/β-catenin信號(hào)通路中TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄達(dá)到消除ROS目的, 最終導(dǎo)致成骨減弱同時(shí)使成骨細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)失衡[32]，引起RANKL與特異性受體RANK結(jié)合, 激活JNK通路、ERK通路、Akt通路與作為下游的NF-κB通路[33]，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞重要的轉(zhuǎn)錄因子如原癌基因c-fos等的表達(dá), 促進(jìn)破骨，阻止破骨細(xì)胞凋亡[32]，而槲皮素[27]、山奈酚[26]、異鼠李素[27]等降低ROS水平或起雌激素樣作用，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)骨代謝。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是細(xì)胞介導(dǎo)胞內(nèi)外刺激傳導(dǎo)的信號(hào)通路，MAPK家族有三大成員，分別為ERK、JNK及p38 MAPK信號(hào)通路，其介導(dǎo)的自噬在調(diào)控破骨細(xì)胞分化中具有重要作用。喻琴云等[29]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)芒柄花素可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9表達(dá), 可誘導(dǎo)P38MAPK發(fā)生磷酸化，并且認(rèn)為后者經(jīng)過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的反應(yīng)過(guò)程活化凋亡的途徑, 導(dǎo)致破骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，考慮與P38MAPK/ MMP-9信號(hào)通路有關(guān)。異鼠李素[34]能顯著減輕過(guò)氧化物誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷和凋亡，經(jīng)過(guò)各級(jí)反應(yīng)進(jìn)而參與ERK通路的激活，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化防御能力，揭示了異鼠李素誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用可能來(lái)自ERK信號(hào)通路的激活。有研究[43]表明PI3K/AKT/FoxO/NF-κB通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與氧化平衡的另一條重要通路，槲皮素可激活此通路促進(jìn)成骨改善OP狀態(tài)。槲皮素[35]能明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1和IL-6炎性蛋白，進(jìn)而抑制炎癥因子刺激破骨細(xì)胞的分化。而JUN家族蛋白中c-jun蛋白作為JNK通路的下游信號(hào)，在骨代謝非經(jīng)典通路中，JNK通路可被激活，募集c-jun激活NF-κB通路進(jìn)而抑制成骨蛋白表達(dá)，介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化[36]；晁杲等[37]通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析認(rèn)為異鼠李素可通過(guò)抑制JNK的活化, 抑制NF-κB通路的活化, 抑制破骨細(xì)胞分化。李婧等[38]揭示異鼠李素對(duì)破骨前體細(xì)胞分化具有抑制作用的機(jī)制可能與NF-κB通路的抑制有關(guān)。Yang等[39]認(rèn)為山奈酚和槲皮素可通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)和雌激素受體通路增加Mg-63型成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)活性，并認(rèn)為山奈酚是一種有效的抗破骨劑。OP往往作為糖尿病并發(fā)癥存在[40]，在AGE-RAGE信號(hào)通路中，AGEs是一種糖基化終產(chǎn)物，能結(jié)合RAGE引起氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)OP；前者還可上調(diào)RAGE的表達(dá)，通過(guò)Wnt/β-catenin 通路交叉作用抑制成骨分化[41]；劉貴波等[42]研究證實(shí)山奈酚可以抑制AGEs誘發(fā)RAGE的表達(dá)，從而可間接地抑制OP發(fā)生。

綜上，本研究顯示當(dāng)歸補(bǔ)血湯能通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用于OP，可能與其發(fā)揮抗氧化作用和雌激素樣作用有關(guān)，可為下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論基礎(chǔ)。