穆國華，趙宗江，蔣 里，趙進喜

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

2010年我國疾病預(yù)防控制中心(CDC)聯(lián)合中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會對我國18歲及以上人群的糖尿病的患病情況進行了調(diào)查，結(jié)果顯示糖尿病患病率高達9.7%[1]，而到2013年時，我國慢性病及其危險因素監(jiān)測顯示，我國18歲及以上人群糖尿病患病率已上升至10.4%[2]。2型糖尿病以高血糖、胰島素調(diào)控葡萄糖代謝能力下降(胰島素抵抗)、胰島β細胞功能缺陷而引起的胰島素分泌減少或相對減少為主要特點，預(yù)防或延緩2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展受到國內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者的重視。中醫(yī)藥對2型糖尿病的防治有一定的優(yōu)勢，黃連、肉桂為交泰丸的組成藥物，交泰丸可以有效改善糖尿病的高血糖狀態(tài)及胰島細胞功能，延緩糖尿病的并發(fā)癥發(fā)病進程[3-5]，但作用機制尚不明確。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的一個重要影響因素，調(diào)節(jié)腸道菌群可以有效調(diào)控血糖[6-7]。實驗研究顯示，腸道菌群紊亂可能與內(nèi)毒素血癥的介導(dǎo)有關(guān)，兩者相互影響，最終引起肥胖和2型糖尿病的發(fā)生[8]。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分，其最主要的成分是脂多糖(LPS)。故本實驗以db/db小鼠為研究對象，通過檢測腸道菌群及LPS含量，探討了黃連、肉桂降低血糖的機制，旨在為黃連、肉桂更好地治療2型糖尿病提供實驗數(shù)據(jù)支持。

1 實驗材料與方法

1.1動物 6周齡SPF級雄性自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠(C57BLKS)30只以及同周齡雄性同窩野生型db/m小鼠6只，均購自常州卡文思實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(蘇2016-0010)，db/m小鼠體重20～25 g,db/db小鼠體重35～40 g，于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所SPF級動物房飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，濕度(50±10)%，每天光照12 h，自由飲水、進食(標準飼料)。本實驗方案得到中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗動物倫理委員會批準(20190710)。

1.2藥物及試劑 二甲雙胍片(商品名：格華止，中美上海施貴制藥有限公司，規(guī)格：0.5 g×20片)。黃連及肉桂購自北京康美制藥有限公司，由北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心進行含量測定，并制成浸膏，均符合2010版《中國藥典》合格標準。

1.3儀器 穩(wěn)豪型血糖試紙，產(chǎn)品標準證號：YZB/USA 0659-2010,強生(上海)醫(yī)療器材有限公司；1.8 mL外旋凍存管，購自corning公司；50 mL離心管，購自corning公司；磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒(DP712)，購自TIANGEN公司；強生穩(wěn)豪型血糖儀(ONETOUCH UltraEasy),強生(上海)醫(yī)療器材有限公司；體重儀(中科生命科技股份有限公司)；臺式高速冷凍離心機，安徽中科中佳，型號：KDC-140HR；DNA抽提試劑盒，DNeasy?PowerSoil?Pro KitQIAGEN美國；測序試劑盒，MiSeq Reagent Kit v3/NovaSeq Reagent KitsIllumina；氣質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫公司(Agilent Technologies Inc.CA,UAS)的8890B-5977B GC/MSD。

1.4實驗方法 所有小鼠按3只/籠飼養(yǎng)于獨立通氣籠系統(tǒng)內(nèi)，室溫(24±2)℃，12 h光照維持，晝夜循環(huán)，自由攝食、飲水。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，測量db/db小鼠尾尖靜脈血糖，選取3次空腹血糖>13 mmol/L(禁食6 h，間隔1 d)的db/db小鼠30只，隨機分為模型組、二甲雙胍組、黃連組、肉桂組、肉桂-黃連組，每組6只，6只同齡的db/m小鼠作為正常組。正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，各藥物組給予相應(yīng)藥物灌胃，均1次/d，連續(xù)8周。其中二甲雙胍成人劑量為1 500 mg/60 kg，黃連∶肉桂=10∶1，小鼠給藥劑量按照人和動物間體表面積進行換算：小鼠劑量(mg/kg)=9.1×人的臨床劑量(mg/kg)。

1.5觀察指標及方法

1.5.1一般情況及體重和血糖水平 實驗過程中觀察各組小鼠的體表特征及行為學(xué)變化；分別于灌胃前(0周)及灌胃后每周測量各組小鼠體重，計算各組小鼠體重的平均值，繪制各組小鼠體重變化的趨勢圖；分別于灌胃前(0周)及灌胃4周、8周后，禁食6 h后尾靜脈取血，采用血糖儀測定各組小鼠血糖。

1.5.2腸道菌群基因測序

1.5.2.1樣品配置 灌胃8周后，采用提尾反射法收集小鼠糞便標本，未排便的小鼠，以無菌棉簽按揉小鼠腹部，刺激小鼠排便，使用無菌EP管收集標本，每管采集3粒糞便，標記后放入-80 ℃低溫冰箱保存。

1.5.2.216S-rDNA提取 添加0.5 g樣品、978 μL Sodium Phosphate Buffer和122 μL MT Buffer到Lysing Matrix E tube；MP研磨儀中震蕩40 s，速度6 m/s；14 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至1.5 mL離心管中，加入250 μL PPS，混勻；室溫14 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至已加入900 μL Binding Matrix的2 mL管中，混勻，上下顛倒3 min；瞬離5 s(即轉(zhuǎn)速剛升上去便停止)，小心倒棄上清；加入500 μL 5.5 mol/L的異硫氰酸胍溶液，混勻，轉(zhuǎn)移到SPINTM Filter中；加入500 μL SEWS-M，14 000 r/min離心1 min，棄濾液，再重復(fù)洗滌1次；棄去收集管中液體，14 000 r/min離心3 min，去除殘留溶液，晾干3 min；加入100 μL 55 ℃預(yù)熱的DES洗脫液，靜置5 min；室溫14 000 r/min離心2 min，棄去SPINTM Filter，得到總DNA。

1.5.2.316S-rDNA檢測 DNA純度和濃度檢測：NanoDrop 2000；DNA完整性檢測方法：1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓5 V/cm，時間為20 min；PCR擴增：將PCR產(chǎn)物采用QuantusTMFluorometer進行定量檢測，按照每個樣本的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合。構(gòu)建PE文庫及Illumina測序，Miseq文庫構(gòu)建，利用Illumina公司生產(chǎn)的Miseq PE300平臺進行測序。

1.5.2.4菌群分析 在門(Phylum)分類水平下進行物種分析；通過樣本層級聚類分析、PCA分析(主成分分析)、PCoA分析(主坐標分析)進行組間Beta多樣性分析，對不同組別的微生物群落間的物種多樣性進行組間比較，以分析不同分組間群落組成的相似性以及差異性，選擇Bray-Curtis距離算法對樣本間菌群的豐度分布差異程度進行量化分析，獲得距離矩陣，制作樣本距離Heatmap圖。

1.5.3血清LPS含量 灌胃8周后，各組小鼠去眼球采血,分離血漿、血清置EP管內(nèi),存于-80 ℃冰箱,樣本集齊后統(tǒng)一處理。采用酶聯(lián)免疫法檢測血清中LPS含量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠一般情況及體重比較 正常組小鼠毛色光亮，行動敏捷，體型瘦長，活動頻繁。各藥物組小鼠形體肥胖，動作遲緩，活動少，攝食及飲水增多，灌胃后期模型組小鼠出現(xiàn)豎毛，體溫偏低，對外界刺激反應(yīng)遲鈍的現(xiàn)象。所有db/db小鼠在開始實驗時體重為40 g左右，db/m小鼠體重在23 g左右；灌胃后與模型組及二甲雙胍組比較，黃連組、肉桂組及黃連-肉桂組小鼠體重增長趨勢減緩，黃連-肉桂組體重增長減緩最明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠灌胃前及灌胃后各周體重變化趨勢

2.2各組小鼠血糖比較 灌胃前，各組db/db小鼠血糖比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；灌胃期間正常組、模型組小鼠血糖相對平穩(wěn)，各藥物組小鼠血糖呈明顯下降趨勢，其中黃連-肉桂組小鼠血糖下降趨勢最為明顯，見圖2；灌胃8周后，模型組小鼠血糖明顯高于其他組(P均<0.05)；黃連組與黃連-肉桂組小鼠血糖均明顯低于二甲雙胍組和肉桂組(P均<0.05)，肉桂組與二甲雙胍組比較、黃連組與黃連-肉桂組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

圖2 各組小鼠灌胃前及灌胃4周、8周血糖變化趨勢

2.3各組小鼠腸道菌群多樣性比較

2.3.1物種分析 與正常組比較，模型組及二甲雙胍組小鼠糞便中后壁桿菌門(Firmicutes)豐度增加，擬桿菌門(Bacteroides)豐度下降。與模型組及二甲雙胍組比較，黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組小鼠糞便中后壁桿菌門豐度明顯下降，其中黃連-肉桂組下降最明顯；黃連-肉桂組擬桿菌門豐度、肉桂組及黃連-肉桂組放線菌門(Actinobacteria)豐度及黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組變形桿菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)豐度明顯增加。見圖3。

表1 各組小鼠灌胃前及灌胃4周、8周血糖水平比較

圖3 各組小鼠腸道菌群門(Phylum)分類水平下物種組成分類

2.3.2Beta多樣性分析 正常組與模型組之間物品組成豐度差異明顯；二甲雙胍組與模型組物種組成豐度相似；黃連組、肉桂組間枝長最短，物種組成豐度相似，其次是與正常組分度相似；黃連-肉桂組與其余組物種組成豐度差異較大。見圖4。

2.4各組小鼠血清LPS含量比較 正常組、模型組、二甲雙胍組、黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組小鼠LPS含量分別為(0.011±0.011)EU/mL、(0.025±0.016)EU/mL、(0.010±0.005)EU/mL、(0.008±0.005)EU/mL、(0.010±0.002)EU/mL、(0.006±0.004)EU/mL，模型組小鼠血清LPS含量明顯高于正常組(P<0.05)，各藥物組均明顯低于模型組(P均<0.05)，各藥物組間比較差異差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，但黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組均有低于二甲雙胍組的趨勢，且黃連-肉桂組最低，其次為黃連組，最后是肉桂組。

3 討 論

黃連、肉桂是交泰丸的組成藥物，早期用來治療由心腎不交而引起的失眠，最早見于明韓懋所著的《韓氏醫(yī)通》：“黃連生用為君，佐官桂少許，煎百沸，入蜜，空心服，能使心腎交于頃刻。”2型糖尿病屬于中醫(yī)“消渴病”的范疇，明何柏齋《醫(yī)學(xué)管見》提出消渴病的病機為：“造化之機，水火而已……交則為既濟，不交則為未濟。消渴證，不交而火偏盛也?！贝死碚摓辄S連、肉桂治療2型糖尿病提供了有力的理論基礎(chǔ)。黃連主要成分是小檗堿，小檗堿是公認的腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)激活劑，可有效治療2 型糖尿病[9]。肉桂的主要成分為桂皮醛和肉桂酸，肉桂酸可促進胰島β細胞分泌胰島素[10]。本研究以db/db小鼠為研究對象，分別用目前公認的一線降糖藥物二甲雙胍和黃連、肉桂以及黃連-肉桂作為干預(yù)措施，探討了黃連、肉桂單用及聯(lián)用治療2型糖尿病的機制。

圖4 各組小鼠腸道菌群樣本距離Heatmap圖

近幾年，腸道菌群對2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的影響成為研究的熱點之一。人類的腸道內(nèi)寄居者數(shù)以千萬的微生物，在正常情況下，各類菌群之間可以互相制約，在一定程度上達到一定的生態(tài)平衡，與人類形成共生關(guān)系，這也是維護人體健康的重要環(huán)節(jié)，一旦這種平衡被打破，將會導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[11]。腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能受到多種因素的影響，如遺傳、飲食、免疫、藥物等，進而可以通過改變代謝的途徑和介導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)等影響人們的糖脂代謝，從而會導(dǎo)致肥胖及2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[12]。腸道菌群從門的水平上可分為5大類，包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、放線菌門和梭形桿菌門，其中約90%由厚壁菌門和擬桿菌門構(gòu)成。擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度和肥胖密切相關(guān)，肥胖小鼠具有更多的厚壁菌門，因為厚壁菌門能攝取更多的能量，使體重增加[13-14]。本實驗結(jié)果顯示，各藥物組小鼠體重增長趨勢均減緩，黃連-肉桂組體重增長減緩最明顯；黃連組、肉桂組、黃連-肉桂組小鼠糞便中后壁桿菌門豐度明顯下降，其中黃連-肉桂組下降最明顯，提示黃連-肉桂可能通過減少db/db小鼠的后壁桿菌豐度而抑制體重增長，與以上研究結(jié)果一致。

LPS被認為是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，其是一種重要的炎癥刺激物，與腸道菌群相互影響，最終可以導(dǎo)致肥胖及2型糖尿病的發(fā)生。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高能量飲食可以造成肥胖小鼠腸道內(nèi)革蘭陰性菌大量繁殖，而革蘭陰性菌可以破壞腸道黏膜屏障，促使腸壁的通透性增加，大量LPS入血并誘發(fā)炎癥免疫反應(yīng)，最終經(jīng)過一系列的反應(yīng)誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生[16-17]。Cani等[18]發(fā)現(xiàn)，健康的小鼠經(jīng)過高脂飼料喂養(yǎng)4周后，小鼠血中 LPS 含量逐漸升高，證實高熱量飲食改變了小鼠的腸道菌群，進而使內(nèi)毒素含量增高，兩者之間具有緊密聯(lián)系；接著向小鼠體內(nèi)連續(xù)低量的持續(xù)注射LPS，小鼠逐漸出現(xiàn)了肥胖，進一步發(fā)展后出現(xiàn)隨機血糖增高和胰島素抵抗。Asghar等[19]研究證實，LPS由革蘭陰性菌裂解后釋放，通過腸壁進入血循環(huán)，可以誘發(fā)“代謝性內(nèi)毒素血癥”的發(fā)生。LPS入血后，結(jié)合LPS結(jié)合蛋白，而后與LPS受體CD14一起作用并激活CD14/Toll樣受體4，從而激活體內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最后會導(dǎo)致大量炎性因子釋放增加，引發(fā)全身慢性非特異性低度炎癥反應(yīng)，這些都可以干擾胰島素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。本實驗結(jié)果顯示，各藥物組小鼠血糖和血清LPS含量均明顯降低，且黃連組和黃連-肉桂組小鼠血糖均明顯低于二甲雙胍組和肉桂組；各藥物組間血清LPS含量比較雖然差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但以黃連-肉桂組最低。提示黃連-肉桂可更有效降低血糖，減少LPS釋放。

綜上所述，黃連-肉桂可以有效降低db/db小鼠血糖，減緩體重增長，可能與其可以有效調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群及減少LPS的釋放有關(guān)。本實驗為黃連-肉桂在2型糖尿病的臨床應(yīng)用中提供了一定數(shù)據(jù)支持。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。