康海英 吳君平 張馬軍 王云卿

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性的，以骨質(zhì)破壞、關(guān)節(jié)功能喪失及慢性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病[1]。其發(fā)病機(jī)制尚未明了，可能與遺傳和內(nèi)外環(huán)境因素有關(guān)[2]。隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，微生物與RA的關(guān)系也受到臨床科研工作者越來越多的關(guān)注，尤其是腸道微生物群。有研究表明，腸道菌群紊亂與RA的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析RA人群與正常人群中腸道菌群的分布特征及差異，旨在為今后RA的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年7月在杭州市余杭區(qū)第五人民醫(yī)院就診的RA患者20例為RA組。本次研究經(jīng)過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者簽署知情同意書。排除：①既往接受過抗風(fēng)濕治療的患者；②接受過激素治療的患者；③近期3個(gè)月內(nèi)接受過抗生素治療的患者；④應(yīng)用過胃腸動(dòng)力藥的患者；⑤合并有胃腸炎病史的患者；⑥合并其他自身免疫性疾病的患者。另外選取同期門診健康體檢者20例為對(duì)照組。RA組中男性7例、女性13例；平均年齡（45.26±8.13）歲；平均病程（3.42±1.10）年；對(duì)照組中男性6例、女性14例；平均年齡（42.64±7.82）歲。兩組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 糞便樣本的采集 所有樣本人群均無特殊飲食習(xí)慣。均在早上6∶00～8∶00用無菌采樣盒收集新鮮糞便標(biāo)本。采樣時(shí)均佩戴無菌手套，手持無菌棉簽迅速取樣后放置于無菌培養(yǎng)盒中，在-18 ℃下冷凍保存，并于24 h內(nèi)完成DNA提取。

1.2.2 總DNA提取 采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取糞便細(xì)菌基因組總DNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3 腸道菌群分析 所有樣本均使用引物338F和80627R進(jìn)行16S rDNA V3～V4可變區(qū)的PCR擴(kuò)增，正向引物序列為5’-ACTCCTACGGGAGGCAG?CA-3’，反向引物序列為5’-GGACTACHVGGGT?WTCTAAT-3’。構(gòu)建MiSeq文庫，使用MiSeq高通量測(cè)序（由美國Illumina公司生產(chǎn)）進(jìn)行雙端測(cè)序。Miseq測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾。獲得優(yōu)化序列后，使用QIIME軟件進(jìn)行操作分類單位（op?erational taxonomic units，OTU）聚類，基于Silva數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋和分類學(xué)分析。

1.3 監(jiān)測(cè)指標(biāo) 比較兩組患者腸道菌群分布的OTU分析、α-多樣性分析、β-多樣性分析及菌群組成差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。組間腸道菌群的α-多樣性采用t檢驗(yàn)，各菌群間差異比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，組間菌群差異采用LDA及LEfSe分析。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組OTU分析見封二圖2

圖2 兩組OTU分析

由封二圖2可見，RA組的腸道菌群豐度低于對(duì)照組，且腸道菌群OTU數(shù)目總和低于對(duì)照組。

2.2 兩組患者腸道菌群的α-多樣性分析見封二圖3

圖3 兩組腸道菌群的a-多樣性分析

由封二圖3可見，RA組Chao和Sobs指數(shù)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=0.01、0.02，P均＜0.05）。

2.3 兩組患者腸道菌群的β-多樣性分析見封三圖4

圖4 兩組患者腸道菌群的β-多樣性分析

由封三圖4可見，基于OTU豐度的主成分分析顯示，RA組的腸道菌群結(jié)構(gòu)明顯與對(duì)照組不同，對(duì)照組的β-多樣性明顯高于RA組，在對(duì)照組中，部分糞便樣本的細(xì)菌群落與RA組相似，而對(duì)照組中其他個(gè)體的微生物組成與RA組完全不同。

2.4 兩組患者腸道菌群組成比較見封三圖5

圖5 兩組腸道菌群分布及差異圖

由封三圖5可見，在屬水平，擬桿菌屬和Faecal?ibacterium菌是兩組人群中豐度最高的菌群，雖然RA組擬桿菌屬和Faecalibacterium菌的豐度高于對(duì)照組，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 LEfSe差異性分析見封三圖6

圖6 LEfSe差異分析圖

由封三圖6可見，兩組患者的腸道菌群構(gòu)成存在顯著差異，其中RA組的Intestinibacter菌屬的相對(duì)豐度高于對(duì)照組，對(duì)照組中乳桿菌屬（Lactobacil?lus）、大腸志賀氏桿菌（Escherichia shigella）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、Candidatus Saccharimonas菌屬、Odoribacter菌屬、腸球菌屬（Enterococcus）相對(duì)豐度明顯高于RA組。

3 討論

RA在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約1%，在發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率為0.5%～1.0%，在我國的發(fā)病率為0.3%～0.6%，且女性發(fā)病率約為男性的2～3倍[4,5]。人體在正常情況下，腸道內(nèi)存在著梭菌、雙歧桿菌及類桿菌等大量定殖細(xì)菌，會(huì)影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境，并促進(jìn)體內(nèi)維生素、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)合成，成為腸道的天然屏障[6]。有研究表明，腸道定殖菌群如果出現(xiàn)菌群結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，會(huì)使腸道的屏障功能減弱，致病菌易侵襲機(jī)體而誘發(fā)疾病，且細(xì)胞因子會(huì)被腸道細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖成分激發(fā)并釋放，這可能是誘發(fā)RA發(fā)病的一個(gè)重要因素[7]。自21世紀(jì)以來，RA患者與健康人之間的菌群差異就得到了系統(tǒng)的論證[8]。但是國內(nèi)RA患者微生物的構(gòu)成比例仍不清楚，以往的研究多采用細(xì)菌培養(yǎng)的方法分析菌群結(jié)構(gòu)，但這種方式受多種因素影響，因此也就不能客觀地評(píng)價(jià)菌群結(jié)構(gòu)以及菌群與疾病的相關(guān)關(guān)系。近來基于16S rDNA基因設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過高通量測(cè)序分析菌群結(jié)構(gòu)，是菌群結(jié)構(gòu)分析的有效方法。16S rRNA測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不必培養(yǎng)細(xì)菌即可檢測(cè)環(huán)境的微量細(xì)菌，同時(shí)隨著宏基因組測(cè)序技術(shù)的日趨成熟，這使系統(tǒng)性分析腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能成為可能。

本研究結(jié)果顯示RA組的腸道菌群豐度、α-多樣性、β-多樣性低于對(duì)照組，這與Chen等[9]、Van de Wiele等[10]的研究結(jié)果一致。在屬水平，擬桿菌屬和Faecalibacterium菌是兩組人群中豐度最高的菌群，雖然RA組擬桿菌屬和Faecalibacterium菌的豐度高于對(duì)照組，但兩組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RA組的Intestinibacter菌屬的豐度增加，乳桿菌屬（Lac?tobacillus）、大腸志賀氏桿菌屬（Escherichia shigel?la）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、Candidatus Sac?charimonas菌屬、Odoribacter菌屬、腸球菌屬（En?terococcus）豐度降低。這表明RA患者的腸道菌群與健康人群存在差異，腸道菌群的組成可能通過改變微生物功能而促進(jìn)RA的發(fā)生或發(fā)展。乳桿菌屬與機(jī)體的免疫應(yīng)答密切相關(guān)，參與機(jī)體的非特異性和特異性免疫應(yīng)答，它可能在RA發(fā)生和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。乳桿菌屬及腸桿菌屬等腸道定植菌群數(shù)量的減少，可能會(huì)阻礙黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟，降低機(jī)體免疫力，增加RA的易感性，激活機(jī)體的自身免疫應(yīng)答，導(dǎo)致RA的發(fā)生。而且機(jī)體腸道微生物在生長(zhǎng)和分裂過程中，肽聚糖會(huì)不斷地從細(xì)胞壁中脫落，并越過腸道屏障進(jìn)入循環(huán)。Huang等[11]的實(shí)驗(yàn)研究表明，腸道微生物群可間接地使肽聚糖增加，導(dǎo)致胞壁酰-L-丙氨酸-D-異谷酰胺濃度升高，激活并觸發(fā)促炎癥信號(hào)通路，促使RA的炎癥反應(yīng)加重。本次研究與Huang等[11]的研究類似，RA患者均發(fā)生腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，提示RA的發(fā)生發(fā)展可能受不同發(fā)病機(jī)制的促進(jìn)或誘導(dǎo)。

腸道菌群與宿主相互作用形成了人體復(fù)雜有序的微生態(tài)系統(tǒng)，物種多樣性豐富，其含量高，數(shù)量約為人體細(xì)胞的10倍。大量研究均表明，腸道菌群除了能維持人體腸道、免疫環(huán)境及生理功能的穩(wěn)態(tài)，還會(huì)影響腸道以外的部位。一項(xiàng)研究曾表明RA的發(fā)生發(fā)展受腸道菌群的差異性及多樣性的影響，菌群紊亂會(huì)促進(jìn)RA形成，而調(diào)整菌群則可有效延緩RA進(jìn)一步發(fā)展[12]。Liu等[13]研究提示了乳桿菌屬與RA的發(fā)生和發(fā)展之間的潛在關(guān)系，這與本次研究的結(jié)果一致。Zhang等[14]通過宏基因組測(cè)序檢測(cè)RA患者治療前后口腔及腸道菌群的變化的研究結(jié)果顯示，RA患者發(fā)病一年后，唾液、牙菌斑和糞便中的唾液乳桿菌均顯著增加，且在疾病處于高度活動(dòng)期的患者中表達(dá)最為明顯，而嗜血桿菌的豐度則明顯下降，且與RA自身免疫抗體的滴度呈負(fù)相關(guān)。表明腸道菌群紊亂與RA疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。但對(duì)于腸道菌群如何影響機(jī)體誘發(fā)RA的機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究和考證。

本次研究為小樣本、單中心的病例對(duì)照研究，可能會(huì)存在組間個(gè)體差異較大的情況，后期應(yīng)增大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的研究。目前RA患者主要以藥物治療為主，治療效果較好，但長(zhǎng)期服藥的副作用較大，探究更有效安全的治療方法勢(shì)在必行。本次研究中RA患者存在一定的腸道菌群紊亂，日后研究可多從腸道菌群調(diào)整角度出發(fā)進(jìn)行探索分析，為RA的防治提供理論依據(jù)。

綜上所述，RA患者的腸道菌群分布與健康人群存在顯著差異，其發(fā)病可能與腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化有關(guān)。而腸道菌群如何影響機(jī)體誘發(fā)RA的機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究和考證。