岳鳳嬌，羅 瀟,2，李海龍,3*

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，云南大理 671000；2.云南昆明血液中心，云南昆明 650000；3.云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000)

微孢子蟲(Micosporidia)是一種廣泛分布于世界各地的細(xì)胞內(nèi)寄生的真核生物，宿主范圍廣，從無脊椎動物到脊椎動物均可感染[1-2]。目前，已報(bào)道的微孢子蟲有1 400多種，150多個(gè)屬，已鑒定出9個(gè)屬的17種微孢子蟲可感染人類[3-4]。其中畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi)是人和其他哺乳動物最為常見的微孢子蟲種類，是一種重要的人獸共患病原體[5]。畢氏腸微孢子蟲分布極為廣泛，傳播方式多樣，受污染的食物和水是感染的主要途徑，免疫力正常人群或動物感染后常表現(xiàn)為食欲減退、輕中度腸痙攣和自限性腹瀉；而免疫力低下者感染后表現(xiàn)為重度腸痙攣和長期腹瀉，嚴(yán)重者會危及生命[6-7]。

獨(dú)龍牛又名“大額?！?Bosfrontalis)，為我國云南省怒江州所獨(dú)有的珍稀牛品種，已被列入國家級畜禽遺傳資源保護(hù)名錄和瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約(2013年)[8-9]。在我國，獨(dú)龍牛僅分布在云南省怒江州獨(dú)龍江和怒江流域(分別位于貢山獨(dú)龍族怒族自治縣和福貢縣)的山區(qū)，地處偏遠(yuǎn)，飼養(yǎng)方式為半野生、半家養(yǎng)(定期喂食鹽)，寄生蟲防治措施相對滯后[10]。獨(dú)龍牛生活的這兩大流域是當(dāng)?shù)鼐用耧嬘盟蜕钣盟闹饕獊碓矗舯华?dú)龍牛人獸共患腸道寄生蟲污染水源，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)對云南省怒江州獨(dú)龍牛畢氏腸微孢子蟲的感染情況進(jìn)行了調(diào)查研究，以期為獨(dú)龍牛畢氏腸微孢子蟲病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 2017年9月至2018年9月采集自云南省怒江州不同地理位置的獨(dú)龍牛糞便樣本1 129份(鳩門當(dāng)218份，亞左洛村231份，古泉村220份，獨(dú)龍江鄉(xiāng)226份，茨開鎮(zhèn)234份)，將采集到的糞便樣本即時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室，置-20℃保存。

1.1.2 主要試劑 2×TaqPCR MasterMix、6×Loading Buffer購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖、DNA Marker DL 500購自TaKaRa公司；糞便DNA抽提試劑盒(stool)購自O(shè)MEGA公司。

1.1.3 主要儀器 TGyrate Basic渦旋混勻儀(OSE-VX-01)，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)(5427R)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀(C-XP-D)，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；穩(wěn)壓電泳儀(EPS300)，上海天能公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA提取 取糞便樣本20 g加水混勻，用60目篩網(wǎng)過濾去除雜質(zhì)，3 000 r/min離心5 min，棄去上清，取沉淀嚴(yán)格按照糞便DNA提取試劑盒使用說明書提取糞便樣本DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)畢氏腸微孢子蟲ITS基因，參考Zhang X X等[11]報(bào)道的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，利用套式PCR對樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。

表1 畢氏腸微孢子蟲套式PCR引物

1.2.3 套式PCR檢測 反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)參照Zhang X X等[11]方法，套式PCR經(jīng)兩輪反應(yīng)，反應(yīng)體系均為25 μL。第一輪PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上游引物(F1)和下游引物(R1)各為0.25 μL，樣本DNA 2 μL，ddH2O 為10 μL；反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min)，最后72℃延伸10 min。第二輪PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上游引物(F2)和下游引物(R2)均為0.25 μL，第一輪PCR產(chǎn)物2 μL，ddH2O為10 μL；反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)(94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 40 s)，最后72℃延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)。

1.2.4 PCR終產(chǎn)物檢測與測序 取6 μL PCR終產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，將擴(kuò)增呈陽性的PCR產(chǎn)物送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast序列比對和同源性分析，并使用MEGA 6進(jìn)化分析軟件，選取Kimura雙參數(shù)模型，bootstrap值設(shè)定為1 000，繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行蟲種鑒定。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 分別按流域、季節(jié)、采樣點(diǎn)的不同計(jì)算獨(dú)龍牛畢氏腸微孢子蟲感染率，采用SPSS軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(P<0.05表示差異顯著)，對5個(gè)地點(diǎn)之間獨(dú)龍牛畢氏腸微孢子蟲陽性率進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

采集到的1 129份獨(dú)龍牛糞便樣品中，經(jīng)套式PCR檢測，共有19份為畢氏腸微孢子蟲陽性樣本，電泳得到的條帶大小約392 bp(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 500；1～8.陽性樣本；9～10.陰性樣本；11～12.陽性對照；13～14.陰性對照

2.2 獨(dú)龍牛畢氏腸微孢子蟲檢測結(jié)果

1 129份獨(dú)龍牛糞便中，經(jīng)套式PCR檢測，總感染率為1.68%(19/1 129，95% CI 0.93%～2.43%)。各采樣點(diǎn)畢氏腸微孢子蟲陽性率如表2所示，5個(gè)點(diǎn)之間兩兩比較，獨(dú)龍江鄉(xiāng)的陽性率明顯高于鳩門當(dāng)?shù)年栃月?，差異顯著(P<0.05)。根據(jù)5個(gè)采樣點(diǎn)的所在流域不同(獨(dú)龍江鄉(xiāng)位于獨(dú)龍江流域，其他4個(gè)點(diǎn)位于怒江流域)，獨(dú)龍江流域(3.54%，8/226)顯著高于怒江流域(1.22%，11/903)(P<0.05)。4個(gè)季度夏季感染率最高(3.26%，9/276)，春、秋、冬3個(gè)季度感染率分別為1.10%(3/272)、1.28%(4/312)、1.12%(3/269)，經(jīng)比較，季節(jié)影響因素?zé)o顯著差異(P>0.05)。

表2 不同地點(diǎn)間陽性檢出率和基因型分布

2.3 ITS基因結(jié)果分析

通過對19份陽性樣本的測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，結(jié)果獲得6種有差異的DNA序列(上傳GenBank號為：MK389483～MK389488)。用MEGA6軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，得到6種基因型，分別是EbpC(n=6)、BEB4(n=4)、CHN3(n=3)、CHN4(n=4)、YNNJ1(n=1)、YNNJ2(n=1)?；贗TS序列構(gòu)建的種系發(fā)育進(jìn)化樹(圖2)表明，EbpC、CHN3、CHN4、YNNJ1和YNNJ2均屬于Group1；BEB4被分到Group2中。檢測的樣品中已知基因型(圖中■表示)和新基因型(圖中●表示)均為人獸共患基因型。

圖2 基于ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

畢氏腸微孢子蟲宿主范圍較為廣泛，是一類能夠感染人類及各種動物的寄生性腸道原蟲[6]。目前，對于獨(dú)龍牛畢氏腸微孢子蟲的檢測國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)所測得獨(dú)龍牛畢氏腸微孢子蟲總感染率為1.68%，低于國內(nèi)其他牛品種的感染率(廣東奶牛犢15.7%，青海牦牛7.03%，新疆奶牛犢16.5%，上海牛犢26.5%)[12-15]，以及國外報(bào)道的美國東部奶牛23.0%、美國東部斷奶后犢牛13.0%、巴西肉牛17.5%、澳大利亞犢牛10.4%[16-19]。本文中獨(dú)龍牛畢氏腸微孢子蟲感染率相對較低，這可能與當(dāng)?shù)氐臍夂?、地理位置及?dú)特的飼養(yǎng)方式有關(guān)。

本研究通過套式PCR對畢氏腸微孢子蟲ITS基因序列進(jìn)行測序分析，共發(fā)現(xiàn)6種基因型。EbpC是畢氏腸微孢子蟲主要基因型，不僅在家畜、野生動物中有分布，在人群中也有發(fā)現(xiàn)，分布較為廣泛[20-21]。數(shù)據(jù)分析表明，BEB4基因型為反芻動物特異性的基因型，已出現(xiàn)宿主范圍擴(kuò)增現(xiàn)象，具有人獸共患潛力。Zhang X等[22]在人和牛的樣本中同時(shí)發(fā)現(xiàn)了畢氏腸微孢子蟲CHN3和CHN4基因型，證明這2種基因型為人獸共患基因型。從同源性角度分析，本試驗(yàn)所得YNNJ1和YNNJ2兩種新基因型與EbpC基因型相近，為人獸共患基因型。本次研究新基因型的發(fā)現(xiàn)，豐富了該蟲種的基因型數(shù)據(jù)，為怒江州獨(dú)龍牛畢氏腸微孢子蟲病的進(jìn)一步研究提供了參考依據(jù)。

獨(dú)龍牛有著良好的肉牛體型，肉質(zhì)細(xì)嫩，具有很高的遺傳資源價(jià)值與經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。畢氏腸微孢子蟲作為導(dǎo)致牛腹瀉的常見病原，可阻礙其養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，怒江州獨(dú)龍牛存在人獸共患基因型的畢氏腸微孢子蟲感染，各個(gè)地點(diǎn)之間差異顯著，不同區(qū)域是畢氏腸微孢子蟲感染的風(fēng)險(xiǎn)因素，獨(dú)龍江鄉(xiāng)感染風(fēng)險(xiǎn)較高；對兩大流域的調(diào)查結(jié)果進(jìn)行分析，怒江州獨(dú)龍牛畢氏腸微孢子蟲的感染主要發(fā)生在獨(dú)龍江流域，當(dāng)?shù)貞?yīng)增強(qiáng)防范意識，加強(qiáng)對水源的管理，及時(shí)做好防控工作，減少人與動物互感的可能。