蘇 倩，翟 帥，孫 柯，林 洋，王騰宇，呼和巴特爾，王文龍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)(Haemonchuscontortus)屬于毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)。寄生于反芻動(dòng)物消化道的圓線蟲(chóng)大多數(shù)為毛圓科，而捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)是其中致病力最強(qiáng)的一種[1]。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)主要以吸食宿主血液為生，導(dǎo)致宿主貧血、消瘦、皺胃黏膜損傷等[2]，嚴(yán)重者可導(dǎo)致宿主，尤其是幼齡宿主死亡。目前捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病呈世界性分布，尤其是熱帶、亞熱帶及降雨量較多地區(qū)[3]。對(duì)于該病的治療，目前主要依賴于阿苯達(dá)唑、伊維菌素、左旋咪唑等驅(qū)蟲(chóng)藥物[4]。而阿苯達(dá)唑作為一種廣譜、高效、低毒的苯并咪唑類抗蠕蟲(chóng)藥物，在國(guó)內(nèi)外均得到了廣泛的應(yīng)用[5]。但因?yàn)槎嗄甑乃幬锸褂貌划?dāng)導(dǎo)致這些寄生性線蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性，即便是英國(guó)、荷蘭、西班牙、瑞士、德國(guó)、波蘭、意大利、法國(guó)、丹麥、瑞典和挪威等[6]一些歐洲國(guó)家也深受其害，這在一定程度上給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重威脅，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道發(fā)現(xiàn)，阿苯達(dá)唑產(chǎn)生耐藥性的主要原因是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的Ⅰ型β微管蛋白(isotype-Ⅰ β-tubulin gene)基因的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)(F167Y，E198A和 F200Y)[7-9]，即167位點(diǎn)由苯丙氨酸突變?yōu)榻j(luò)氨酸(TTC-TAC)，198位點(diǎn)由谷氨酸突變?yōu)楸彼?GAA-GCA)，200位點(diǎn)由苯丙氨酸突變?yōu)榻j(luò)氨酸(TTC-TAC)。眾所周知，內(nèi)蒙古自治區(qū)是中國(guó)最大的草原牧區(qū)和重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地，掌握內(nèi)蒙古地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)阿苯達(dá)唑耐藥情況，對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病的防控來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，因此，本實(shí)驗(yàn)室一直在內(nèi)蒙古地區(qū)展開(kāi)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐藥性調(diào)查[10]，本試驗(yàn)選取耐藥蟲(chóng)株，對(duì)其種群阿苯達(dá)唑耐藥性Ⅰ型β-tubulin基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品蟲(chóng)株 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)株采自于內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗、烏蘭察布市察右后旗和興安盟科右前旗，根據(jù)雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)的形態(tài)特征，體視顯微鏡下鑒定后分裝到凍存管中，標(biāo)記好后存入液氮中。

1.1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，天根生化科技公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增用試劑，TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖，BIOWEST公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(PowerCycler384)、水平凝膠電泳儀(BG-subMIDI)，北京百晶生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)楊新[11]的方法，由北京六合華大基因科技有限公司分別合成針對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)核糖體第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔基因(ITS-2)序列和Ⅰ型β-tubulin基因序列的特異性引物，上、下游引物序列見(jiàn)表1。

表1 ITS-2和Ⅰ型β-tubulin基因引物序列

1.2.2 蟲(chóng)體基因組DNA提取 分別取鄂爾多斯市烏審旗、烏蘭察布市察右后旗和興安盟科右前旗3個(gè)地區(qū)各19條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雄蟲(chóng)，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取DNA。

1.2.3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS-2基因擴(kuò)增鑒定 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaqTM12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸 30 s，共 35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Ⅰ型β-tubulin基因擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaqTM12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性40 s，53℃退火40 s，68℃延伸 40 s，共40個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸7 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 測(cè)序分析 將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Ⅰ型β-tubulin基因擴(kuò)增產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)ITS-2基因擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增后，3個(gè)地區(qū)蟲(chóng)樣電泳結(jié)果顯示(圖1)，擴(kuò)增出大小約265 bp的條帶，與ITS-2基因預(yù)期大小一致，證明這3個(gè)地區(qū)各自的19條雄蟲(chóng)樣品均為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)，可以用作后續(xù)試驗(yàn)使用。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～19.樣品ITS-2基因PCR產(chǎn)物；20.陽(yáng)性對(duì)照；21.陰性對(duì)照

2.2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Ⅰ型β-tubulin基因擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增后，電泳結(jié)果顯示(圖2)，3個(gè)地區(qū)57條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雄蟲(chóng)DNA樣本均擴(kuò)增出大小約385 bp的條帶，與Ⅰ型β-tubulin基因基因預(yù)期大小一致，擴(kuò)增產(chǎn)物可以用于后續(xù)測(cè)序分析。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～19.樣品Ⅰ型β-tubulin基因PCR產(chǎn)物；20.陽(yáng)性對(duì)照；21.陰性對(duì)照

2.3 測(cè)序結(jié)果分析

對(duì)內(nèi)蒙古3個(gè)地區(qū)57條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雄蟲(chóng)Ⅰ型β-tubulin基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)Chromas軟件統(tǒng)計(jì)分析基因序列峰圖后，顯示內(nèi)蒙古3個(gè)地區(qū)57條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雄蟲(chóng)Ⅰ型β-tubulin基因167位點(diǎn)均未發(fā)生突變，全部為純合敏感型。而198位點(diǎn)，烏審旗有1條(5.26%)為純合耐藥型，2條(10.53%)為雜合耐藥型，16條(84.21%)為純合耐藥型；200位點(diǎn)，烏審旗有16條(84.21%)為純合敏感型，2條(10.53%)為雜合耐藥型，1條(5.26%)為純合耐藥型，見(jiàn)表2。察右后旗198位點(diǎn)有8條(42.10%)為純合敏感型，5條(26.32%)為雜合耐藥型，6條(31.58%)為純合耐藥型；200位點(diǎn)有6條(31.58%)為純合敏感型，11條(57.89%)為雜合耐藥型，2條(10.53%)為純合耐藥型，見(jiàn)表3?？朴仪捌煊?98位點(diǎn)有1條(5.26%)為純合敏感型，18條(94.74%)為純合耐藥型；200位點(diǎn)有18條(94.74%)為純合敏感型，1條(5.26%)為雜合耐藥型，見(jiàn)表4。綜合分析這3個(gè)地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雄蟲(chóng)Ⅰ型β-tubulin基因序列發(fā)現(xiàn)有4種基因型，分別是198純合耐藥型及200純合敏感型：烏審旗16條84.21%，察右后旗6條31.58%，科右前旗18條94.74%。198純合敏感型及200純合耐藥型：烏審旗1條5.26%，察右后旗2條10.53%。198純合敏感型及200雜合耐藥型：察右后旗6條31.58%，科右前旗1條5.26%。198及200均雜合耐藥型：烏審旗2條10.53%，察右后旗5條26.32%，見(jiàn)表5。

表2 內(nèi)蒙古鄂爾多斯市烏審旗Ⅰ型β-tubulin基因3個(gè)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性

表3 內(nèi)蒙古烏蘭察布市察右后旗Ⅰ型β-tubulin基因3個(gè)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性

表4 內(nèi)蒙古興安盟科右前旗Ⅰ型β-tubulin基因3個(gè)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性

表5 內(nèi)蒙古地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Ⅰ型β-tubulin基因的基因型及其頻率

3 討論

阿苯達(dá)唑在1976年被美國(guó)SmithKline & Beecham公司研制開(kāi)發(fā)，1977年首次應(yīng)用，中國(guó)獸藥監(jiān)察所在1979年開(kāi)發(fā)成功，1981年試生產(chǎn)后，到現(xiàn)在這幾十年來(lái)，廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)畜禽蠕蟲(chóng)病臨床防治，在一定程度上促進(jìn)了我國(guó)畜牧行業(yè)的發(fā)展[5]。但根據(jù)國(guó)外Kotze等對(duì)某一類藥物產(chǎn)生耐藥性的物種首次被報(bào)道時(shí)間的統(tǒng)計(jì)與藥物研發(fā)時(shí)間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)情況下，耐藥性是在每個(gè)藥物組引入后的10年內(nèi)出現(xiàn)的[13]。所以目前國(guó)內(nèi)外捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐藥性的問(wèn)題日趨嚴(yán)重。

本試驗(yàn)對(duì)內(nèi)蒙古烏審旗、察右后旗和科右前旗3個(gè)地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)阿苯達(dá)唑耐藥種群Ⅰ型β-tubulin基因3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)地區(qū)167位點(diǎn)均未發(fā)生突變，這也與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的調(diào)查結(jié)果相一致[14-15]，而198和200位點(diǎn)則有突變，總體上看198位點(diǎn)突變頻率高于200位點(diǎn)。但據(jù)國(guó)外報(bào)道，檢測(cè)到167、200位點(diǎn)突變頻率高，198位點(diǎn)未發(fā)生突變[16]。這說(shuō)明地區(qū)不同，3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變的頻率也不相同。分析這57條雄蟲(chóng)基因序列發(fā)現(xiàn)4種基因型，分別是198純合耐藥型及200純合敏感型、198純合敏感型及200純合耐藥型、198純合敏感型及200雜合耐藥型和198及200均雜合耐藥型。Barrere等報(bào)道當(dāng)10%的個(gè)體具有抗性基因型(TAC/TAC200、TAC/TAC167或TTC/TAC167、TAC/TTC200)時(shí)，一個(gè)種群被認(rèn)為是耐藥的。但由于文獻(xiàn)中沒(méi)有描述耐藥的閾值，所以10%的閾值是任意選擇的。當(dāng)在一個(gè)特定農(nóng)場(chǎng)估計(jì)的耐藥捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的比例超過(guò)這一閾值時(shí)，假定該特定農(nóng)場(chǎng)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)為阿苯達(dá)唑耐藥型[9]。耐藥基因型頻率烏審旗為100%，察右后旗68.42%，科右前旗94.74%，這已經(jīng)大大地超過(guò)了10%，表明這3個(gè)地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)對(duì)阿苯達(dá)唑耐藥性嚴(yán)重。額葉勒德格在2018年通過(guò)對(duì)烏審旗地區(qū)綿羊主要蠕蟲(chóng)病流行病學(xué)及驅(qū)蟲(chóng)效果調(diào)查研究，表明該地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染率較高，且為優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種，對(duì)丙硫咪唑產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性[17]。趙學(xué)亮等[18]2018年通過(guò)糞便蟲(chóng)卵減少試驗(yàn)對(duì)烏蘭察布市察右后旗羊場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，也存在耐藥性，這表明與國(guó)際公認(rèn)的糞便蟲(chóng)卵減少試驗(yàn)(FECRT)結(jié)果一致，說(shuō)明Ⅰ型β-tubulin基因3個(gè)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法可靠。Barrere等也認(rèn)為這是一個(gè)檢測(cè)苯并咪唑類耐藥性比較有效的方法，而且可以在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)低感染量時(shí)檢測(cè)出其耐藥情況，以便提前隔離治療。本研究結(jié)果為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病的預(yù)防和治療提供了新思路，可有效避免或減緩捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)耐藥性的產(chǎn)生，進(jìn)一步推動(dòng)養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)疾病防控的發(fā)展，為養(yǎng)殖戶減少一定的經(jīng)濟(jì)損失。