田宇杰，嵇辛勤，章麗嬌，劉青濤，韓凱凱，楊 婧，劉宇卓，趙冬敏，劉 娜，王夢瑤，李 銀*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部 動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014；3 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550025)

自2010年4月以來，江蘇、浙江、福建、安徽、江西和河北等省的鴨發(fā)生了一種以產(chǎn)蛋率、采食量顯著下降，具有腦炎樣神經(jīng)癥狀的傳染病，引起該病的病原為一種新的黃病毒，即鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)[1-2]。感染DTMUV的鴨群主要表現(xiàn)為采食驟降、產(chǎn)蛋驟降乃至停產(chǎn)的主要臨床特征，并伴有食欲減退、高熱、排綠色糞便及運動障礙，有的出現(xiàn)精神沉郁、共濟失調(diào)，嚴重者發(fā)生死亡。該病在我國大部分養(yǎng)鴨地區(qū)均有流行，已成為危害水禽養(yǎng)殖的重要傳染病之一[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，我國7省(區(qū))產(chǎn)蛋鴨群存在DTMUV的嚴重感染，應(yīng)引起高度重視[4]。

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，家禽感染AIV后，有的不表現(xiàn)臨床癥狀，有的表現(xiàn)為呼吸道疾病和產(chǎn)蛋下降，嚴重的可導(dǎo)致全身性疾病。自20世紀90年代以來，H9N2亞型AIV已在世界多個國家和地區(qū)發(fā)展成地方流行并形成了穩(wěn)定的種系,是當(dāng)前禽流感流行的主要病毒亞型之一，嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。通過對水禽流感監(jiān)測、病毒分離鑒定及基因樹分析表明，無論是哺乳動物還是雞源禽流感病毒，均可從鴨等水禽分離到。隨養(yǎng)殖量的漸增，水禽AIV(H9亞型)發(fā)生普遍，造成減蛋減產(chǎn)，誘發(fā)免疫抑制易繼發(fā)感染，為其他亞型AIV提供基因供體。鴨等水禽兼具AIV(H9亞型)儲存宿主、傳染源和易感者[5]，因此，從源頭上控制和消滅鴨的H9亞型禽流感會起到事半功倍的作用。在鴨的養(yǎng)殖過程中，DTMUV和AIV(H9亞型)常常混發(fā)和繼發(fā)[6]，并且癥狀和病變相似不易區(qū)分。盡快研制出能有效防控 H9亞型AIV和TMUV的疫苗十分重要。

佐劑能誘發(fā)機體產(chǎn)生長期、高效的特異性免疫反應(yīng)，提高機體保護能力，同時減少免疫物質(zhì)的用量，降低疫苗生產(chǎn)成本。由于佐劑各自性質(zhì)不同而導(dǎo)致刺激機體抗體產(chǎn)生水平和持續(xù)期也存在較大差異，所以不同佐劑制成的疫苗的免疫效果也會有差別[7]。二聯(lián)疫苗中兩種抗原相混具有稀釋作用，為保證二聯(lián)疫苗的免疫效果，本試驗對鴨二聯(lián)疫苗的佐劑進行對比篩選，即將不同佐劑與相同含量的坦布蘇病毒病和H9亞型禽流感兩種抗原制成滅活疫苗，免疫櫻桃谷肉鴨，通過測定抗體水平篩選理想的二聯(lián)疫苗佐劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與病毒株 24日齡非免疫鴨櫻桃谷鴨,購自南京大廠區(qū)某養(yǎng)鴨場，AIV(H9亞型)HI抗體與DTMUV ELISA抗體均為陰性。鴨源H9亞型AIV NJ01株，DTMUV JS804株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病實驗室分離、鑒定、保存。

1.1.2 主要試劑 卡波姆(971P)購自北京國人逸康科技有限公司；鋁膠、白油均購自南京天邦生物科技有限公司；蜂膠購自威海百合生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 立式蒸汽滅菌器(SY-450)購自徐州圣華醫(yī)療器械有限責(zé)任公司；酶標(biāo)儀(ELx800)購自美國伯騰儀器公司(Biotek)；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)購自南京優(yōu)普試驗儀器有限公司；二級生物安全柜購自西班牙Telsta BioIIA公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-916A)購自上海光都儀器設(shè)備有限公司；精密電子天平(AA200)購自美國丹佛儀器公司(Denver Instrument); 高速冷凍離心機購自德國艾本德公司(Eppendorf)；低溫冰箱購自海爾公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備 將DTMUV JS804株和AIV(H9亞型)NJ01株分別接種BHK-21細胞和SPF雞胚進行增殖，DTMUV與AIV(H9亞型)尿囊液均采用1/1000 β丙內(nèi)酯滅活。將滅活后的AIV(H9亞型)與DTMUV液按照1∶2比例混合作為二聯(lián)抗原，分別與不同佐劑制成二聯(lián)疫苗。

1.2.2 不同佐劑滅活疫苗的制備 ①卡波姆佐劑?？ú纺敢旱呐渲疲悍Q取卡波姆(971 P)粉末，用無菌超純水膨脹過夜，使用1 mol/L NaOH(PBS配制)調(diào)pH7.0，用滅菌PBS定容，使卡波姆濃度為6 mg/mL，高壓滅菌后即為母液。取卡波姆母液分別與二聯(lián)抗原和滅菌PBS配制，體積占比均為1/3，卡波姆終濃度為2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL的卡波姆佐劑疫苗，分別標(biāo)記為1號、2號、3號疫苗。②鋁膠佐劑疫苗。取7.5 g鋁膠，加入50 mL PBS，充分溶解，用乳化儀低速攪拌，溶解后的鋁膠與二聯(lián)抗原以2∶1的體積比混合，攪拌1 min，標(biāo)記為4號疫苗。③白油佐劑疫苗。取47 mL白油與3 mL司本-80混合后高溫滅菌，作為油相；取二聯(lián)抗原25 mL，加入1.5 mL吐溫-80混勻，作為水相；油相經(jīng)過乳化儀低速攪拌后加入水相，體積比為2∶1，再高速攪拌1 min，標(biāo)記為5號疫苗。④蜂膠佐劑疫苗 取3 g蜂膠，加入50 mL 950 mL/L酒精，37℃溶解24 h后取出，按照蜂膠∶二聯(lián)抗原∶滅菌PBS=1∶1∶1比例配制，攪拌1 min，標(biāo)記為6號疫苗。

1.2.3 疫苗的免疫接種 取1月齡非免疫鴨49只，隨機平分成7組，第1組～第6組按表1腿部肌肉注射不同佐劑的滅活疫苗，第7組接種滅菌PBS作為空白對照。

表1 動物分組及免疫情況

1.2.4 免疫效果的檢測 血清制備：分別于免疫前及免疫后1、2、3周翅靜脈采血，37℃放置1 h，4℃條件下過夜后，經(jīng)3 000 r/min離心5 min，分離血清，取上清液，置-20℃保存。H9亞型禽流感抗體的測定：參照常規(guī)血凝抑制試驗[8]，AIV的血凝抑制效價≥1∶8(23)判定為陽性。坦布蘇病毒抗體的檢測：參照文獻[9]阻斷ELISA方法的操作程序進行。阻抑率≥30%為陽性。

2 結(jié)果

2.1 免疫前后抗體抗體效價變化

抗體檢測結(jié)果均為陰性。對1月齡櫻桃谷鴨進行首免，21 d后二次免疫，間隔1周采集鴨血清，采用血凝抑制HI試驗進行抗體檢測(圖1)。白油組于一免后14 d HI效價到達3 log2，抗體產(chǎn)生期較短，之后抗體水平持續(xù)升高，二免后HI效價能到達10 log2，明顯高于其他各組；其他組別則于二免后產(chǎn)生較高水平抗體，抗體產(chǎn)生期慢且水平較低。

圖1 免疫后鴨抗AIV HI抗體水平變化情況

2.2 免疫后坦布蘇病毒抗體效價的變化

對1月齡櫻桃谷鴨進行首免，21 d后二次免疫，間隔1周采集鴨血清，采用阻斷Elisa方法進行抗體檢測(圖2)。白油組與卡波姆各組基本于一免后14 d產(chǎn)生較高水平抗體，其中白油組產(chǎn)生抗體水平較高，而卡波姆各組中4 mg/L組較高，鋁膠組和蜂膠組抗體產(chǎn)生期長，抗體水平不高。

圖2 免疫后鴨抗DTMUV抗體水平變化情況

3 討論

卡波姆無毒、無刺激性，可增強機體特異性免疫能力。本試驗所用卡波姆971P，其黏度(厘泊數(shù))為2 000～11 000 cP，常用于口服、局部給藥、控釋骨架片、助懸劑[10]。標(biāo)有字母P是唯一可用于口服或與黏膜接觸的藥用級別的聚合物。卡波姆單獨作為佐劑或其與免疫刺激復(fù)合物的混合物作為佐劑能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平細胞免疫和體液免疫應(yīng)答[11]?？ú纷鳛橐环N新型佐劑被廣泛應(yīng)用于疫苗研制，本試驗卡波姆佐劑疫苗免疫效果比油佐劑要差，水佐劑各組中免疫效果最好。

蜂膠是蜜蜂采集植物幼芽分泌的樹脂，并混入蜜蜂上腭腺分泌物、蜂蠟、花粉及其他一些有機物和無機物的一種天然物質(zhì)[12]。具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、增強機體免疫功能和促進組織再生等作用。能刺激機體細胞免疫、體液免疫、紅細胞免疫系統(tǒng)和巨噬細胞補體系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，作為佐劑具有良好的免疫增強作用。本試驗中蜂膠佐劑疫苗免疫效果不理想，可能由于蜂膠劑型、工藝指標(biāo)、產(chǎn)地等不同造成有效含量不同所致，或是雜質(zhì)含量多未能充分溶解，蜂膠有效含量不足，影響免疫效果。鋁膠佐劑能起到抗原儲存庫和傳遞作用，可引起機體產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，增強固有免疫、獲得性免疫及激活補體系統(tǒng)[13]。鋁膠佐劑疫苗進入機體后會形成一個富含巨噬細胞的肉芽腫，持續(xù)刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本試驗表明鋁膠佐劑疫苗免疫效果并不理想。

白油佐劑的作用機制是抗原包被在油相形成的微結(jié)構(gòu)內(nèi)，產(chǎn)生的儲庫效應(yīng)能使抗原緩慢釋放，刺激B淋巴細胞產(chǎn)生抗體[14]。白油是經(jīng)超深度精制脫芳烴、硫和氮等雜質(zhì)而得到的特種礦物油品，其對各種細胞因子具有較強的刺激作用，促進抗體產(chǎn)生。本次試驗表明，白油佐劑免疫效果最佳。白油佐劑DTMUVD-AIV(H9)二聯(lián)滅活疫苗免疫效果最好，抗體產(chǎn)生快、抗體滴度高，且高滴度抗體持續(xù)時間長，為制備本疫苗的首選佐劑。另外有研究表明白油可與IL-2混合作為佐劑的DTMUVD 滅活疫苗，比單獨白油佐劑疫苗具有更好的免疫效果，可為DTMUVD-H9AI二聯(lián)滅活疫苗的佐劑選擇提供參考[15]?？ú纷魟└鹘M于免疫后14 d可產(chǎn)生較高的坦布蘇病毒病抗體，提示可作為坦布蘇病毒病疫苗理想佐劑，但禽流感抗體產(chǎn)生較慢，至二免后才產(chǎn)生較高水平抗體，但抗體效價比白油佐劑疫苗低，說明其整體免疫效果低于白油佐劑疫苗組。

由上述可知該白油組較其他各組刺激機體產(chǎn)生的抗體水平更高，抗體產(chǎn)生早,而其他各組均為水佐劑組，說明二聯(lián)苗中油佐劑較水佐劑組免疫效果更好；而水佐劑中卡波姆免疫效果最好，且二免后能達到免疫保護所需抗體水平?？紤]到油佐劑疫苗在免疫過程中出現(xiàn)肌肉炎性反應(yīng)，卡波姆可作為疫苗佐劑較為理想的選擇之一。實踐中應(yīng)考慮到在充分發(fā)揮動物巨大的免疫潛力的同時應(yīng)避免由于加載過多的成分而導(dǎo)致動物免疫能力及生理能力的浪費，因此研制適合家禽的微量、安全、高效、精準的新型疫苗將成為未來疫苗發(fā)展的方向[16]。