崔芳微，郭東光，李文明，朱艷平，李 鵬，孫國鵬，岳 鋒，王選年*

(1.新鄉(xiāng)學院生物技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州大學，河南鄭州 450000)

沙丁胺醇(salbutamol,SAL)別名為舒喘寧，化學名被稱為4-羥基-5-羥甲基苯基-α(叔丁胺)甲基苯乙醇胺[1]，是人工合成的腎上腺素藥物，具有β2-受體激動劑的作用，為白色結(jié)晶性粉末(圖1)。SAL與“瘦肉精”克侖特羅促生長效果相同[2]，其性質(zhì)及檢測方法的研究相對較少，檢測手段也較滯后，因而逐步取代鹽酸克侖特羅成為不法分子謀取暴利的新手段，造成的不良影響和危害也日趨嚴重，也越來越引起人們的重視。

圖1 SAL化學結(jié)構(gòu)式

目前，檢測沙丁胺醇的方法有高效液相色譜法(HPLC)[3-5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[6]和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[7]等。雖然GC-MS、HPLC和LC-MS方法準確可靠，但樣品前處理繁瑣，對儀器設備以及操作過程的要求較高，不適于生產(chǎn)、基層單位及現(xiàn)場檢測，而SAL的快速檢測對SAL監(jiān)督起著至關重要的作用[8-9]。因此，針對當前SAL使用現(xiàn)狀，建立快速、靈敏、方便的檢測技術(shù)，對食品中SAL殘留物的檢測及防控具有重要的現(xiàn)實意義。免疫分析技術(shù)是一種常用的快速檢測技術(shù)，特別是近年來在食品分析中得到越來越廣泛的運用，其中ELISA法具有操作簡便、快速、特異性和靈敏度高，費用低等優(yōu)點，能夠用于SAL檢測的定性及定量測定，是當前應用最為廣泛的獸藥殘留的檢測方法[10]。

因此，本研究通過制備沙丁胺醇完全抗原，獲得針對SAL的多克隆抗體，以此為基礎通過對反應條件的優(yōu)化建立了檢測SAL的間接競爭ELISA(ic-ELISA)檢測方法，為進一步開發(fā)快速檢測SAL試劑盒和膠體金免疫層析試紙條奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 沙丁胺醇(salbutamol,SAL)、特布他林(terbutaline,TBL)、西馬特羅(cimaterol,CIM)、鹽酸克侖特羅(clenbuterol hydrochloride,CLB)、鹽酸齊帕特羅(zilpaterol hydrochloride,ZIL)、鹽酸多巴胺(3-hydroxytyramine hydrochloride,DH)、萊克多巴胺(ractopamine,RAC)、達氟沙星(danofloxain,DAN)、泰樂菌素(tylosin,TYL)標準品，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant,FCA)、雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant,FIA)，德國Sigma公司產(chǎn)品；琥珀酸酐、三硝基苯磺酸、HRP-羊抗兔IgG，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物 新西蘭大白兔體重約1.5 kg，由新鄉(xiāng)學院生物技術(shù)研究中心提供。

1.1.3 主要儀器 多功能酶標儀(Enspire)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；加熱磁力攪拌器(CMAGHS4)，德國IKA公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(UV-3010)，日本Hitachi公司產(chǎn)品；透析袋(MD25)，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 SAL完全抗原的制備及鑒定 用琥珀酸酐法先將SAL的羥甲基與琥珀酸酐發(fā)生醇解反應，生成琥珀酸衍生物(SAL-HS)(圖2)。用混合酸酐法，以三乙胺作為催化劑，將SAL-HS與BSA載體蛋白偶聯(lián)，合成SAL-BSA完全抗原[11](圖3)。參考史曉亞等人的方法[12]，用活化酯法，將SAL-HS與OVA載體蛋白偶聯(lián)，合成SAL-OVA完全抗原(圖4)。使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測人工抗原SAL-BSA和SAL-OVA的濃度，并用SDS-PAGE法和紫外光譜掃描法鑒定是否偶聯(lián)成功。根據(jù)Torres等所述[13]，利用三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid sol,TNBS)法檢測SAL-BSA與SAL-OVA的偶聯(lián)比。

圖2 SAL-HS合成過程

圖3 完全抗原SAL-BSA合成過程

圖4 完全抗原SAL-OVA合成過程

1.2.2 多克隆抗體的制備 選擇健康的新西蘭大白兔3只，體重1.5 kg左右，免疫劑量為500 μg/只，1 mL/只，用等體積的弗氏佐劑進行乳化，乳化完全后進行背部皮下多點注射。首免后每隔20 d進行下一次免疫，免疫劑量、方法同首免。第3次、第4次免疫后10 d，耳緣靜脈取血2 mL，37℃放置2 h后，4℃過夜，6 000 r/min離心5 min，吸取血清，用于檢測抗血清效價。7 d后進行心臟釆血，37℃放置2 h后，4℃過夜，6 000 r/min離心5 min，得到SAL抗血清，分裝后置-20℃保存[14]。

1.2.3 ic-ELISA的基本步驟

(1)包被：將檢測原(SAL-OVA)用包被緩沖液稀釋到合適濃度，100 μL/孔加入96孔酶標板中，4℃包被過夜。

(2)封閉：甩去孔內(nèi)液體，PBST-50 g/L脫脂奶粉洗滌5次，每次3 min；每孔加入200 μL封閉液，于37℃恒溫箱中孵育2 h，甩干孔內(nèi)液體，洗滌5次。

(3)競爭反應：將0.5 μg/mL的標準品稀釋成系列濃度，50 μL/孔加入到已固定抗原的酶標板中；再向板中加入稀釋至合適濃度的抗體50 μL/孔，37℃反應30 min，洗滌5次，甩干。

(4)加酶標二抗：每孔加入100 μL 10 000倍稀釋的HRP-羊抗兔IgG，37℃反應30 min，洗滌5次，甩干。

(5)顯色：每孔加顯色液100 μL，室溫避光顯色15 min，每孔加入50 μL終止液終止反應。

(6)測定：酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光值(OD)。

(7)計算：使用Origin 9.0軟件中的四參數(shù)擬合函數(shù)對數(shù)據(jù)進行擬合，以標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，以吸光值B/B0作為縱坐標繪制標準曲線，計算其最大吸光值Amax和半數(shù)抑制濃度IC50。綜合考慮Amax、IC50和Amax/IC50，確定ic-ELISA的最佳反應條件。Amax/IC50的比值越大，說明該方法的靈敏度越高。其中抑制率的計算公式如下：抑制率%=(SAL抗血清效價-SAL抗血清抑制)/SAL抗血清效價×100%。

1.2.4 ic-ELISA條件的優(yōu)化[15]

(1)最佳包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)的確定：利用棋盤法，確定合適的包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)。將包被原稀釋成濃度為1 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL和7 μg/mL的濃度包被酶標板，抗體按1∶400～1∶25 600梯度進行倍比稀釋，按照步驟1.2.3測定，測定0 μg/L和0.5 μg/mL的SAL標準品在OD 450 nm處的吸光值，選擇OD 450 nm在1.0～1.5之間的包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)組合繪制抑制曲線。對比不同組合的Amax和IC50及其兩者的比值，確定最佳的包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)。

(2)最佳標準品稀釋液的確定：在上述最佳反應條件下，分別用PBS、PBST-50 g/L脫脂奶和PB 3種稀釋液稀釋標準品，按步驟1.2.3測定，對比不同種類的標準品稀釋液Amax和IC50及其兩者的比值，確定最佳的標準品稀釋液。

(3)最佳競爭反應時間的確定：在上述最佳反應條件下，將標準品與SAL抗血清的競爭反應時間設定為30 min、45 min、60 min、90 min，按步驟1.2.3測定，對比不同競爭反應時間Amax和IC50及其兩者的比值確定最佳的競爭反應時間。

(4)最佳二抗反應時間的確定：在上述最佳反應條件下，設置二抗反應時間為15 min、30 min、60 min和90 min，按步驟1.2.3測定，對比不同二抗反應時間Amax和IC50及其兩者的比值，確定最佳的二抗反應時間。

(5)最佳二抗稀釋度的確定：在上述最佳反應條件下，將二抗稀釋倍數(shù)按1∶3 000、1∶5 000、1∶7 000和1∶9 000共4個梯度進行倍比稀釋，按步驟1.2.3測定，對比不同稀釋濃度Amax和IC50及其兩者的比值確定最佳的二抗稀釋度。

(6)最佳顯色時間的確定：在上述最佳反應條件下，設定四組顯色時間，分別是5 min、8 min、10 min和15 min，按步驟1.2.3測定，對比不同顯色時間Amax和IC50及其兩者的比值，確定最佳的顯色時間。

1.2.5 ic-ELISA標準曲線的建立 根據(jù)上述確定的最佳ic-ELISA反應條件，按步驟1.2.3測定，繪制其標準曲線。以標準品對抗原抗體特異性結(jié)合的抑制率達到50%時對應的標準品濃度作為半數(shù)抑制濃度，以標準品對抗原抗體特異性結(jié)合的抑制率達到20%～80%時所對應的標準品濃度作為標準曲線的檢測范圍，以標準品對抗原抗體特異性結(jié)合的抑制率達到10%時對應的標準品濃度作為最低檢測限[15]。

1.2.6 方法特異性 選取CLB、ZIL、RAC、DAN、CIM、TBL、DH和TYL作為抑制物，評價該方法的特異性。按步驟1.2.3測定，繪制標準曲線，計算相對應的交叉反應率。公式：CR%=IC50(標準品)/IC50(結(jié)構(gòu)類似物)×100%。

1.2.7 精密度試驗 選擇3個標準品SAL質(zhì)量濃度(2.5 μg/L、25 μg/L和250 μg/L)，將每個濃度重復測定3次，計算變異系數(shù)(CV)。變異系數(shù)(CV)%=標準差/平均值×100%。

1.2.8 回收率 稱取SAL標準品添加到尿樣中，分別配成2.5 μg/L、25 μg/L和250 μg/L濃度的溶液，用已建立的ic-ELISA方法進行回收試驗，計算回收率。計算公式如下：回收率%=實際測定的濃度/添加的濃度×100%。

2 結(jié)果

2.1 完全抗原的鑒定

2.1.1 SDS-PAGE法鑒定 采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測SAL-BSA和SAL-OVA的濃度分別為1.95 mg/mL和2.2 mg/mL。將制備得到的SAL-BSA和SAL-OVA完全抗原，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析(圖5，圖6)。SAL-BSA和SAL-OVA的條帶明顯高于BSA和OVA的條帶，表明SAL與BSA、OVA偶聯(lián)成功。

M.蛋白分子質(zhì)量標準; 1,3.BSA載體蛋白; 2,4.SAL-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物

M.蛋白分子質(zhì)量標準; 1.OVA載體蛋白; 2.SAL-OVA偶聯(lián)產(chǎn)物

2.1.2 紫外光譜掃描法鑒定 將小分子(SAL)、載體蛋白(BSA、OVA)及偶聯(lián)物(SAL-BSA、SAL-OVA)進行紫外光譜掃描鑒定(圖7A，7B)。載體蛋白BSA和OVA分別在276 nm和278 nm處出現(xiàn)了最高吸收峰，小分子SAL在225 nm和277 nm處各出現(xiàn)了最高吸收峰，SAL-BSA和SAL-OVA分別在274 nm和275 nm處出現(xiàn)了最高吸收峰，相比于載體蛋白，由于助色團的作用，偶聯(lián)物均發(fā)生了藍移，形成了一種新的共軛結(jié)構(gòu)，導致其紫外吸收光譜發(fā)生了改變[16]。因此可以判斷完全抗原制備成功。

A.SAL-BSA紫外光譜掃描；B.SAL-OVA紫外光譜掃描

2.1.3 偶聯(lián)比的測定 根據(jù)TNBS法建立標準曲線[15]，測得SAL-BSA的偶聯(lián)比為17∶1，SAL-OVA的偶聯(lián)比為6.4∶1。由此說明該完全抗原具有良好的免疫原性，能夠產(chǎn)生高特異性抗體。

2.2 抗血清的評價

經(jīng)過4次免疫，最終得到的血清作為抗血清，在優(yōu)化好的條件下測定抗體效價，抗體的效價可達1∶102 400(表1)。

表1 SAL抗血清評價結(jié)果

2.3 抗原、抗體最適工作濃度的確定

根據(jù)實際ic-ELISA檢測的經(jīng)驗，當0 μg/L的標準液OD 450 nm值為1.2～1.8，最高濃度標準液(0.5 μg/mL)的OD 450 nm值在0.1～0.3之間時，繪制標準曲線的梯度和線性關系良好。綜合考慮最大吸光值(Amax)、半數(shù)抑制濃度(IC50)和兩者之間的比值來選擇最佳反應條件，IC50值低、Amax/IC50值高所對應的反應條件為最佳反應條件(表2)。因此最佳包被原濃度為3 μg/mL，SAL抗血清最佳稀釋度為1∶12 800。

表2 包被原濃度與抗體稀釋倍數(shù)的確定

2.4 優(yōu)化標準品稀釋液、競爭反應時間、二抗反應時間與稀釋倍數(shù)、顯色時間

不同標準品稀釋液條件的比較(圖8A)，經(jīng)過優(yōu)化，最終選擇PBST-50 g/L脫脂奶作為標準品稀釋液；在以上確定最佳條件的基礎上，其他條件的比較情況如圖8B～8E所示，最終確定最佳競爭反應時間為1 h(圖8B)；最佳二抗反應時間為30 min(圖8C)；最佳二抗稀釋倍數(shù)為1∶5 000(圖8D)；最佳顯色時間為10 min(圖8E)。

A.標準品稀釋液; B.競爭反應時間; C.二抗反應時間; D.二抗稀釋倍數(shù); E.顯色時間

2.5 ic-ELISA方法的建立及標準曲線的繪制

按照上述ELISA條件優(yōu)化的結(jié)果，得到SAL ic-ELISA方法的最佳反應條件。以SAL標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標(x)，以吸光值B/B0為縱坐標(y)，應用Origin 9.0軟件中的四參數(shù)擬合競爭標準曲線，在上述最優(yōu)條件下建立ic-ELISA的標準曲線(圖9)。其曲線的回歸方程為y=A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)∧p)，相關系數(shù)R2為0.967 2，IC50為24.84 μg/L，最低檢測限(IC10)為0.78 μg/L，線性范圍IC20-IC80為3.16 μg/L～80.1 μg/L。

圖9 ic-ELISA檢測SAL標準曲線

2.6 特異性分析

SAL抗血清與側(cè)鏈上含有叔丁基官能團的結(jié)構(gòu)類似物有較強的交叉反應，例如與CLB、TBL的交叉反應率均在100%左右，與其他小分子的交叉反應率均<0.1%(表3)。

表3 SAL抗血清與結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應率檢測

2.7 精密度檢測

精密度以樣品測定值的變異系數(shù)來表示。選取3個SAL標準品濃度(2.5 μg/L、25 μg/L和250 μg/L)，將每個濃度反復測定3次，計算CV。3個標準品濃度所對應的CV分別為5.37%、7.61%和5.45%，其平均CV為6.14%。CV<10%，表明該方法精密度較好。

2.8 回收率的測定

ic-ELISA方法準確度以回收率表示，選擇2.5 μg/L、25 μg/L、250 μg/L 3個添加水平進行SAL添加回收試驗，將每個濃度反復測定3次，最終確定為豬尿中樣品的平均回收率在98%～110%之間(表4)，證明了檢測方法的可靠性，適用于實際樣品中SAL的檢測。

表4 SAL抗血清在豬尿樣品中的回收率

3 討論

偶聯(lián)物中的偶聯(lián)比對于刺激機體產(chǎn)生高特異性抗體有一定影響，偶聯(lián)率太低容易引起無關的免疫應答；過高易誘導低特異性抗體的產(chǎn)生，Erlanger[17]認為偶聯(lián)比一般在5∶1～25∶1較為合適。因SAL半抗原本身沒有可以直接與載體蛋白上的氨基偶聯(lián)的活性基團，需要將其改造成含有氨基、羧基等基團的衍生物，然后再與載體蛋白偶聯(lián)[18]。由于免疫系統(tǒng)一般對遠離載體端的結(jié)構(gòu)識別能力較強，對連接端識別能力較弱，文獻中通常選擇遠離待測物特征結(jié)構(gòu)的官能團作為連接臂的結(jié)合位點[19]。而SAL主要含有的活性基團是羥基，含有羥基的半抗原衍生物的制備方法有一氯醋酸法、對氨基苯甲酸法和琥珀酸酐法；琥珀酸酐法的優(yōu)點在于用琥珀酸酐將SAL?；螅瑫纬梢粋€含4個碳的間隔臂的中間產(chǎn)物，這樣就突出了SAL半抗原決定簇的特征結(jié)構(gòu)，有助于制備出特異性強的抗SAL抗體[20]。因此，本研究中選擇琥珀酸酐法制備SAL琥珀酸衍生物，再利用混合酸酐法和活化酯法分別制備SAL-BSA和SAL-OVA完全抗原，進一步保證了機體免疫系統(tǒng)對所制備的完全抗原具有良好的識別能力。本研究結(jié)果顯示，將偶聯(lián)成功的SAL-BSA免疫新西蘭大白兔，SAL-OVA用于檢測免疫效果，四免后的兔血清效價可達到102 400，且抗血清對SAL的IC50為24.84 μg/L，成功獲得了效價良好的抗SAL多抗。

雖然已有不少文獻報道制備出了抗SAL單抗并建立了類似的檢測方法，例如，胡穎[1]成功制備了抗SAL單克隆抗體，并且與CLB的交叉反應率只有38%，而與其他結(jié)構(gòu)類似物均無交叉反應；李春生[21]的結(jié)果也顯示了制備出的抗SAL單克隆抗體只與CLB有交叉反應，其交叉反應率為26.09%，而與其它結(jié)構(gòu)類似物沒有交叉反應，說明單克隆抗體相比于多克隆抗體其特異性高，比較穩(wěn)定，但是制備周期長，過程復雜，容易造成污染。而多克隆抗體制備周期短，并且能識別多個抗原表位，即使有個別抗原表位被破壞，試驗結(jié)果影響也不大，但是多克隆抗體很難避免非特異性反應。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)所制備的抗SAL多抗血清也存在非特異性反應現(xiàn)象，與CLB和TBL的交叉反應率分別為108.57%和95.14%。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，有如此高的交叉反應率是因為在三者的側(cè)鏈上都具有相同的叔丁基官能團，下一步將通過尋求新的半抗原改造方法避免此種現(xiàn)象的發(fā)生。但是這種交叉反應的存在也為后期應用該抗體建立同時檢測多殘留物的方法奠定了研究基礎。

在建立ic-ELISA的過程中，ic-ELISA條件優(yōu)化對方法敏感性至關重要，因抗體和標準品在不同緩沖體系中分散能力不同，所以需要找到抗體和標準品最適合的溶劑，經(jīng)試驗驗證，最終選擇PBST-50 g/L脫脂奶作為標準品稀釋液。此外，反應時間長短決定抗原抗體是否充分結(jié)合，所以要優(yōu)化競爭反應時間達到最佳反應程度。蛋白性質(zhì)不同，抗原抗體反應所需最佳濃度、緩沖體系、離子濃度、反應時間等參數(shù)也有所差異[22]；針對各種因素，本研究設置了標準品稀釋液、競爭反應時間、二抗反應時間與稀釋倍數(shù)、顯色時間共5組條件進行優(yōu)化，最終建立了檢測SAL的ic-ELISA檢測方法。

綜上所述，本研究以合成SAL人工抗原為基礎獲得抗SAL的多抗，成功建立了檢測SAL的ic-ELISA檢測方法，為建立同時檢測多殘留物的快速檢測方法奠定了基礎。