陳 宇，米榮升，龔海燕，程 龍，王 旭，韓先干，黃 燕，陳兆國(guó)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241)

通過(guò)控制DNA合成以及細(xì)胞分裂所需基因的表達(dá)，E2F轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控動(dòng)物和植物的細(xì)胞周期[1]。E2F蛋白包含一個(gè)DNA結(jié)合(DNA-binding,DB)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)二聚伙伴(dimerization partner,DP)結(jié)構(gòu)域，以及反式激活結(jié)構(gòu)域和口袋蛋白(pocket proteins)結(jié)合的殘基[2]。E2F的活性由視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma protein,Rb)及其他“口袋”蛋白(pocket proteins)家族成員p107和p130調(diào)節(jié)，它們結(jié)合并抑制E2F活性，調(diào)控細(xì)胞增殖。除了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)外，這些口袋蛋白-E2F復(fù)合物還是信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，這些信號(hào)通路可觸發(fā)多種細(xì)胞過(guò)程，包括增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)?？诖鞍椎牟划?dāng)失活是癌細(xì)胞保持異常增殖的常見(jiàn)機(jī)制?？诖鞍?E2F的解離及隨后E2F的活化是由細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶磷酸化(cyclin-dependent kinase phosphorylation)或病毒癌蛋白(viral oncoproteins，如SV40 T抗原)結(jié)合誘導(dǎo)的[1]。

E2F家族包含8個(gè)成員，其中5個(gè)(E2F1～E2F5)與口袋蛋白形成復(fù)合物。E2F1～E2F3與Rb特異結(jié)合，在細(xì)胞周期的G1期至S期作為轉(zhuǎn)錄的有效激活因子。這些“激活”的E2Fs也會(huì)特異性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。E2F4與所有3種口袋蛋白均可形成復(fù)合物，與E2F5一起被認(rèn)為是一種抑制因子，常位于被抑制基因的啟動(dòng)子，抑制細(xì)胞分裂和促進(jìn)細(xì)胞分化，從而在G0/G1期阻滯細(xì)胞周期，并在口袋蛋白釋放時(shí)從細(xì)胞核中釋放[1-2]。

頂復(fù)門原蟲DNA結(jié)合蛋白的作用也已有所研究。Naor A等[3]發(fā)現(xiàn)，采用MYR依賴的弓形蟲(Toxoplasmagondii)致密顆粒蛋白易位(MYR-dependent translocation of dense granule proteins)來(lái)誘發(fā)一系列重要宿主反應(yīng)，與細(xì)胞周期尤其是包括細(xì)胞周期素E(cyclin E)在內(nèi)的E2F轉(zhuǎn)錄因子的靶點(diǎn)有關(guān)。隨后，該研究組發(fā)現(xiàn)了一種新的效應(yīng)蛋白——HCE1，弓形蟲將其輸送到人類細(xì)胞的細(xì)胞核中，在那里調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，包括編碼細(xì)胞周期蛋白E基因。而細(xì)胞周期蛋白E是控制人類細(xì)胞何時(shí)分裂、是否分裂的最關(guān)鍵蛋白之一。作者發(fā)現(xiàn)，HCE1通過(guò)與特定的轉(zhuǎn)錄因子，即E2F3、E2F4和DP1結(jié)合而發(fā)揮作用，而這些轉(zhuǎn)錄因子通常精細(xì)地調(diào)控很多重要的通路，表明這些感染因子可利用人類細(xì)胞高效生長(zhǎng)[4]。而頂復(fù)門原蟲AP2 DNA結(jié)合蛋白(Apicomplexan AP2 DNA binding proteins,ApiAP2s)是一類經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的轉(zhuǎn)錄因子，作為分化的潛在調(diào)控因子已被廣泛研究。以往的研究顯示，單獨(dú)的ApiAP2s敲除能夠調(diào)節(jié)緩殖子的分化，但不能完全消除分化。與ApiAP2相對(duì)應(yīng)的Myb樣轉(zhuǎn)錄因子(Myb-like transcription factor1)緩殖子形成缺陷1(bradyzoite-formation deficient 1,BFD1)近期亦被鑒定為是細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠感染時(shí)弓形蟲分化的必需和充分的調(diào)控因子[5]。

與其他頂復(fù)門原蟲相比，隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)調(diào)節(jié)因子的特性和功能研究還非常匱乏。Oberstaller J等[6]通過(guò)對(duì)3 281個(gè)基因在感染后7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)譜進(jìn)行了聚類分析，識(shí)別在體外上皮細(xì)胞培養(yǎng)的前72 h內(nèi)表現(xiàn)出類似表達(dá)模式的基因。結(jié)果在基因簇的上游序列中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)可能作為順式調(diào)控元件的DNA基序，與蛋白質(zhì)DNA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)相一致，排在超表達(dá)最前列的分別是E2F(5′-TGGCGCCA-3′)、G-box(5′-G.GGGG-3′)、ApiAP2結(jié)合基序(5′-TGCAT-3′)，以及一個(gè)未知基序(5′-[A/C]AACTA-3′)。根據(jù)假定的ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子cgd8-810序列，表達(dá)獲得了一個(gè)重組微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)DNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，采用蛋白結(jié)合微陣列確定了其結(jié)合特異性。研究結(jié)果表明，cgd8-810很可能與超表達(dá)的G-box基序結(jié)合，該ApiAP2轉(zhuǎn)錄因子參與了許多基因簇的調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，C.parvum對(duì)ApiAP2調(diào)節(jié)因子的依賴程度較低，部分原因是它利用了E2F/DP1轉(zhuǎn)錄因子[7]。

目前，隱孢子蟲可用的分子遺傳學(xué)研究工具非常少，也缺乏持續(xù)的體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染體系，需要通過(guò)動(dòng)物宿主繁殖蟲體，純化足夠數(shù)量的細(xì)胞內(nèi)發(fā)育階段蟲體用于后續(xù)分子研究十分困難和昂貴，導(dǎo)致目前對(duì)C.parvum的基因調(diào)控知之甚少。本實(shí)驗(yàn)室在研究微小隱孢子蟲類鈣調(diào)蛋白(C.parvumcalmodulin-like protein,CpCML)互作蛋白時(shí)，通過(guò)酵母雙雜交篩選到一個(gè)候選互作蛋白cgd8-1850，經(jīng)BLASTA和生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)其可能是包含E2F樣結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子(C.parvumE2F like domain containing transcription factor,CpELD)。本研究擬對(duì)CpELD編碼基因進(jìn)行原核和真核表達(dá)，對(duì)其免疫反應(yīng)性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步驗(yàn)證其性質(zhì)與功能，以及與CpCML的互作關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、細(xì)胞、DNA 質(zhì)粒pMD18T購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；原核表達(dá)載體pET32a、真核表達(dá)載體p3xFLAG CMV14和pCMV-HA(N)、293T細(xì)胞、微小隱孢子蟲cDNA由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 主要試劑 KOD FX DNA聚合酶、DNA Marker DL 2000、DNA Marker DL5000、6×Loading Buffer、限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ和KpnⅠ)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；無(wú)縫克隆連接酶購(gòu)自Invitrogen公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；AxyPrep DNA膠回收試劑盒購(gòu)于Axygen公司；DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)、胎牛血清、2.5 g/L Trypsin-0.53 mmoL/L EDTA、青霉素和鏈霉素(10 000 U/mL)均購(gòu)自Gibco公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；胰蛋白胨、酵母提取物均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；脫脂奶粉購(gòu)自BD公司；Ni-NTA-His結(jié)合樹(shù)脂親和層析購(gòu)于Novagen；瓊脂糖購(gòu)自BLOWEST公司；辣根過(guò)氧化物 酶(HRP)、鼠抗Flag標(biāo)簽單抗、兔抗HA標(biāo)簽單抗、羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自Cell美國(guó)Signaling公司；胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；PBS購(gòu)自Solarbio公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自VWR公司；質(zhì)粒小提試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(內(nèi)含核酸洗脫液 TB)、Enhanced HRP-DAB Charomogenic Substrate Kit均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；預(yù)混合濃縮膠和預(yù)混合分離膠均購(gòu)自新賽美生物科技有限公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自Whatman公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(S1000TM Thermal Cycle)、垂直電泳儀(PwerPacTM HC High-Current)、Bio-RAD電泳槽(MINI 4)、ChemiDocTMTouchImaging System(ChemiDocTMTouch)，美國(guó)Bio-RAD公司產(chǎn)品；分光光度計(jì)(NanoDrop 2000c)，ThermoFisher公司產(chǎn)品；紫外分析儀(KH-UVⅢ)，上海康禾光電儀器有限公司產(chǎn)品；微量恒溫器(HW-8C型)，紹興市衛(wèi)星醫(yī)療設(shè)備制造有限公司產(chǎn)品；微波爐(G80F20CN2L-B8)，廣東格蘭仕電器公司產(chǎn)品；可調(diào)節(jié)恒溫水槽(DK-8D)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；精密電子天平(AL104)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；Mini離心機(jī)(X1)，韓國(guó)Gene公司產(chǎn)品；恒溫生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；-80℃冰箱(Heto Ultra Freeze UF5410)，捷克Thermo Electron公司產(chǎn)品；-20℃冰箱(BC/BD-379H)，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)(JJ-CJ-1FD)，吳江市凈化設(shè)備總廠產(chǎn)品；高速低溫臺(tái)式離心機(jī)(5810-R)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱(3110)，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；超聲破碎儀(VCx750)，美國(guó)Sonics公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 CpELD蛋白特性的初步生物信息學(xué)分析 從GenBank下載CpELD(登陸號(hào)：EAK89387)的氨基酸序列信息及其編碼基因cpeld核苷酸序列，利用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站cryptoDB在線分析蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和氨基酸長(zhǎng)度，并進(jìn)行蛋白的功能預(yù)測(cè)。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上cpeld基因序列(登陸號(hào)：EAK89387)，應(yīng)用Primer Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了原核和真核表達(dá)引物，分別在原核表達(dá)引物中插入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ(見(jiàn)表1)；在真核表達(dá)引物中插入EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)以及保護(hù)性堿基，同時(shí)，在上游引物中加入了一段Kozak翻譯起始序列(GCCACC)。根據(jù)GenBank中微小隱孢子蟲CML基因序列(登錄號(hào)：EAK87541)，設(shè)計(jì)1對(duì)真核表達(dá)擴(kuò)增引物(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增所需的特異性引物

1.2.3cpeld基因的PCR擴(kuò)增 以微小隱孢子蟲cDNA為模版，分別以cpeld F、cpeld R為引物，擴(kuò)增cpeld。以Flag-cpeld F、Flag-cpeld R和HA-CML F、HA-CML R擴(kuò)增cpeld(e)和CML。在50 μL PCR反應(yīng)體系中，包括ddH2O 13 μL，2×PCR緩沖液(Mg2+)25 μL，dNTP混合物(2.5 mmol/L)8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,1 μL KOD FX(5 U/μL)，cDNA模板2 μL。cpeldPCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。cpeld(e)反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。CML反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在12 g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆鑒定 將膠回收的cpeld基因片段用分光光度計(jì)測(cè)量核酸濃度后，連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的平板上涂板培養(yǎng)后，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化菌送至上海擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并與NCBI上公布的基因序列比對(duì)。

1.2.5 原核和真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 將鑒定正確的菌液用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定后通過(guò)T4連接酶連接到表達(dá)載體pET32a載體上，并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化菌送至上海擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將cpeld(e)和CML基因片段用無(wú)縫克隆連接酶分別連接到p3XFLAG-CMV14載體和pcmv-HA(N)載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR、序列測(cè)定正確的轉(zhuǎn)化菌用質(zhì)粒小體試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用EcoRⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。用無(wú)內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒提取鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌，用分光光度計(jì)測(cè)量濃度，命名p3XFLAG-CMV14-cpeld和pcmv-HA-CML。

1.2.6 原核表達(dá) 將鑒定正確的pET32a-cpeld重組質(zhì)粒BL21(DE3)轉(zhuǎn)化菌按1∶100的比例分別接種到含有50 μg/mL氨芐抗性的1L液體LB培養(yǎng)基中，于37℃中以200 r/min速度搖菌培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD值達(dá)到0.6時(shí)，取1 mL菌液作為陰性對(duì)照，剩余樣品加入IPTG使終濃度為0.8 mmol/L，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h。以8 000 r/min離心15 min收集菌體沉淀，用約35 mL的結(jié)合緩沖液重懸沉淀。在冰浴中超聲破碎(400 W，超聲5 s，停5 s)30 min。將超聲產(chǎn)物在4℃下以14 000 r/min離心20 min，分別收集上清和沉淀，取30 μL制樣并加入6×蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.7 重組蛋白的純化 在純化柱里加入2 mL Ni-NTA-his結(jié)合樹(shù)脂，用15 mL結(jié)合緩沖液洗滌樹(shù)脂。將超聲后的誘導(dǎo)產(chǎn)物上清加入純化柱，重復(fù)3次以上，冰浴30 min后，加入10 mL洗滌緩沖液洗去除雜質(zhì)。分別用5 mL的20、40、60、80、100、120、200、250 mmol/L濃度梯度的咪唑洗脫。分別收集流出樣品，取30 μL制樣并加入6×蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.8 真核表達(dá) 將儲(chǔ)存于液氮中的293T細(xì)胞復(fù)蘇后，于37℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T貼壁細(xì)胞用胰酶消化，按每孔0.3×106個(gè)細(xì)胞，以2 mL細(xì)胞完全培養(yǎng)液懸浮，置于6孔板中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。約80%細(xì)胞融合時(shí)，以LipofectamineTM2000為轉(zhuǎn)染試劑，參照說(shuō)明書方法，分別共轉(zhuǎn)染p3XFLAG-CMV14-cpeld和pcmv-HA-CML，以及p3XFLAG-CMV14和pcmv-HA(N)質(zhì)粒。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞6 h后，把培養(yǎng)液更換為含20 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h～36 h。

1.2.9 Western blot分析 收集純化后原核表達(dá)產(chǎn)物超濾柱濃縮液30 μL，以pET32a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌超聲裂解上清為對(duì)照，加入6×蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min后，取10 μL進(jìn)行電泳分析。在轉(zhuǎn)染了真核重組質(zhì)粒的細(xì)胞中加入300 μL 細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞，離心后吸取上清50 μL，加入 10 μL的 6×蛋白上樣緩沖液，煮沸離心后，取 15 μL用于電泳分析。將經(jīng)SDS-PAGE電泳條帶轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，4℃封閉過(guò)夜。原核表達(dá)產(chǎn)物一抗為鼠抗His單克隆抗體(1∶1 000 稀釋)，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶5 000稀釋)；真核表達(dá)產(chǎn)物一抗為鼠抗Flag單抗和兔抗HA單抗(均為1∶1 000稀釋)，二抗為HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(1∶5 000稀釋)。用Enhanced HRP-DAB Charomogenic Substrate Kit反應(yīng)5 min～10 min后拍照。

2 結(jié)果

2.1 CpELD理化特性的生物信息學(xué)初步分析

軟件分析顯示，CpELD有293個(gè)氨基酸殘基，分子量為31.3 ku，等電點(diǎn)(pI)為7.2。染色體定位分析表明，cpeld分布在C.parvumIowa Ⅱ株的8號(hào)染色體上，無(wú)內(nèi)含子，與Protein Data Bank(PDB)公布的1cf7的B鏈(1CF7-B)相似，一致性為37%。蛋白質(zhì)特性分析發(fā)現(xiàn)，CpELD包含3個(gè)蛋白質(zhì)資源信息系統(tǒng)(InterPro)公布的結(jié)構(gòu)域PFAM(InterPro ID:IPR003316)、SMART(InterPro ID:IPR003316)和SUPERFAMILY(InterPro ID:IPR036390)。GO功能預(yù)測(cè)分析顯示，該蛋白具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA模板化功能；在細(xì)胞組成上，該蛋白可作為轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物；在分子功能上，該蛋白具有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性。

2.2 cpeld及CML基因的PCR擴(kuò)增

以微小隱孢子蟲卵囊cDNA為模版，利用合成的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得用于原核表達(dá)的cpeld、用于真核表達(dá)的cpeld(e)和CML基因，大小分別為882、940和720 bp(圖1)，與預(yù)期大小一致。序列測(cè)定結(jié)果顯示，所獲基因序列與NCBI上報(bào)道的cpeld(cgd8-1850)(登陸號(hào)：EAK89387)、CML基因序列(登錄號(hào)：EAK87541)相同。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～6.cpeld基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；7～11.真核表達(dá)用cpeld(e)基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；12～17.CML基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；N.陰性對(duì)照

2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pMD18T-cpeld經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定(圖2)，片段大小正確。將酶切產(chǎn)物膠回收后，與經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切的pET32a載體連接，序列測(cè)定結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET32a-cpeld插入片段位點(diǎn)正確，無(wú)堿基突變。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4.重組質(zhì)粒pMD18T-cpeld的雙酶切產(chǎn)物；5.未酶切的重組質(zhì)粒pMD18T-cpeld DNA

2.4 原核表達(dá)純化

用T4-DNA連接酶將cpeld連接到PET-32a載體上，將重組質(zhì)粒pET32a-cpeld轉(zhuǎn)化的到大腸埃希氏菌BL21(DE3)經(jīng)中表達(dá)重組融合蛋白。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，在IPTG濃度為0.8 mmol/LIPTG，37℃誘導(dǎo)6 h后時(shí)，SDS-PAGE分析顯示出現(xiàn)明顯的表達(dá)條帶，大小約為55 ku(圖3)。經(jīng)Ni-NTA-His結(jié)合樹(shù)脂親和純化，考馬斯藍(lán)染色顯示，誘導(dǎo)的pET32a-cpeld重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌上清經(jīng)純化后得到一條大小約55 ku的蛋白條帶，與預(yù)期分子質(zhì)量一致(圖4)。

M.低蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.轉(zhuǎn)入pET32a-cpeld的BL21(DE3)誘導(dǎo)1、3、5、6、8 h；6.誘導(dǎo)6 h的pET32a-cpeld轉(zhuǎn)化BL21(DE3)裂解產(chǎn)物上清；7.誘導(dǎo)6 h的pET32a-cpeld轉(zhuǎn)化BL21(DE3)裂解產(chǎn)物沉淀；N.轉(zhuǎn)入pET32a質(zhì)粒的BL21(DE3)誘導(dǎo)產(chǎn)物

M.低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；1～9.20、40、60、80、100、120、200、250 mmol/L咪唑洗脫產(chǎn)物

2.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用無(wú)縫克隆方法，將p3XFLAG-CMV14和pcmv-HA(N)載體EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切產(chǎn)物，分別與cpeld及CMLPCR產(chǎn)物用無(wú)縫克隆連接酶連接，重組質(zhì)粒p3XFLAG-CMV14-cpeld和B：pcmv-HA-CML經(jīng)序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)無(wú)堿基突變。

2.6 Western blot 分析

用小鼠抗His單克隆抗體反應(yīng)，結(jié)果顯示，pET32a-cpeld轉(zhuǎn)化菌上清純化產(chǎn)物在大小約55 ku處出現(xiàn)明顯的反應(yīng)條帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌無(wú)反應(yīng)條帶；共轉(zhuǎn)染p3XFLAG-CMV14-cpeld和pcmv-HA-CML質(zhì)粒的293T細(xì)胞蛋白，用鼠抗Flag、兔抗HA標(biāo)簽抗體反應(yīng)，結(jié)果分別在大小約為38 ku、27 ku處出現(xiàn)明顯的反應(yīng)條帶，與預(yù)期大小相符；而共轉(zhuǎn)染了p3XFLAG-CMV14、pcmv-HA(N)空載體的293T細(xì)胞組均未出現(xiàn)反應(yīng)條帶(圖5)。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET32a轉(zhuǎn)化的大腸埃希氏菌裂解液上清與鼠抗His單克隆抗體反應(yīng)；2.pET32a-cpeld轉(zhuǎn)化菌上清純化產(chǎn)物與鼠抗His單克隆抗體反應(yīng)；3.p3XFLAG-CMV14空載體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，一抗為鼠抗Flag標(biāo)簽抗體；4.共轉(zhuǎn)染p3XFLAG-CMV14-cpeld和pcmv-HA-CML質(zhì)粒的293T細(xì)胞蛋白，一抗為鼠抗Flag標(biāo)簽抗體；5.共轉(zhuǎn)染p3XFLAG-CMV14-cpeld和pcmv-HA-CML質(zhì)粒的293T細(xì)胞蛋白，一抗為兔抗HA標(biāo)簽抗體；6.pcmv-HA(N)空載體共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞蛋白，一抗為兔抗HA標(biāo)簽抗體

3 討論

關(guān)于微小隱孢子蟲CML的研究報(bào)道較少，其特性和功能并不十分清楚。通過(guò)查找與其互作的蛋白，有助于深入了解其功能和作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)室在前期工作中，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與微小隱孢子蟲CML互作的蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)蛋白為CpELD。本研究利用在線生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)，CpELD包含3個(gè)蛋白質(zhì)資源信息系統(tǒng)(InterPro)公布的結(jié)構(gòu)域：PFAM(InterPro ID:IPR003316)、SMART(InterPro ID:IPR003316)和SUPERFAMILY(InterPro ID:IPR036390)。其中PFAM被描述為E2F/DP家族翼螺旋DNA結(jié)合域(E2F/DP family winged-helix DNA-binding domain)；SUPERFAMILY被描述為翼螺旋DNA結(jié)合域(winged helix DNA-binding domain)。GO功能預(yù)測(cè)分析顯示，在生化過(guò)程中，該蛋白具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA模板化功能；在細(xì)胞組成上，該蛋白可作為轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物；在分子功能上，該蛋白具有DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，CpELD與PDB中公布的1cf7的B鏈(1CF7-B)相似，一致性為37%。1cf7是異二聚體細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子E2F-DP識(shí)別DNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(structural basis of DNA recognition by the heterodimeric cell cycle transcription factor E2F-DP)，在細(xì)胞分裂過(guò)程中，E2F/DP(E2 factor)轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控G期到M期調(diào)控基因的表達(dá)，故 E2F/DP 轉(zhuǎn)錄因子家族是調(diào)節(jié)動(dòng)、植物體細(xì)胞周期的“開(kāi)關(guān)分子”[8]，對(duì)其功能和作用機(jī)制的研究，有助于深入了解隱孢子蟲的發(fā)育調(diào)控機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)用價(jià)值。

為獲得表達(dá)水平高、易于溶解和純化的蛋白產(chǎn)物，選擇一個(gè)合適的表達(dá)系統(tǒng)十分重要的?，F(xiàn)有的基因表達(dá)系統(tǒng)主要包括真核和原核兩大系統(tǒng)，其中原核表達(dá)系統(tǒng)主要為大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)。本研究通過(guò)構(gòu)建原核和真核表達(dá)質(zhì)粒來(lái)分別進(jìn)行研究，原核表達(dá)采用了pET32a表達(dá)載體，該載體表達(dá)效率高，表達(dá)的重組蛋白含有His，為后期使用Ni-NTA-His結(jié)合樹(shù)脂進(jìn)行親和層析純化提供了方便，并且His標(biāo)簽小，故對(duì)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)影響小。SDS-PAGE分析顯示，誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌裂解上清和沉淀都出現(xiàn)了明顯區(qū)別于誘導(dǎo)的空載體轉(zhuǎn)化菌裂解物，在上清和沉淀中均有目的蛋白。由于上清中的目的蛋白是以可溶形式存在，利于純化，具有活性的可能性較大，便于后續(xù)驗(yàn)證與CML相互作用研究，所以本試驗(yàn)選擇了上清中的重組蛋白。經(jīng)Ni-NTA-His結(jié)合樹(shù)脂親和層析法對(duì)可溶表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化，Western blot分析顯示，純化的融合蛋白能被鼠抗His標(biāo)簽單抗識(shí)別，在分子質(zhì)量約為55 ku處出現(xiàn)反應(yīng)條帶，與預(yù)期大小一致，而陰性對(duì)照沒(méi)有相同的條帶，表明重組表達(dá)的rCpELD具有良好的反應(yīng)原性。

為便于后續(xù)利用免疫共沉淀等技術(shù)驗(yàn)證CpCML與CpELD互作，本研究成功地構(gòu)建了微小隱孢子蟲cpeld(cgd8-1850)、CpCML基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒p3XFLAG-CMV14-cpeld和pcmv-HA-CML，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，Western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分別在約38 ku和27 ku處出現(xiàn)清晰的反應(yīng)條帶，與目的蛋白大小一致，表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒p3XFLAG-CMV14-cpeld和pcmv-HA-CML在293T細(xì)胞中成功地進(jìn)行了高效表達(dá)，且表達(dá)蛋白的反應(yīng)原性良好。表達(dá)蛋白帶有Flag和HA標(biāo)簽，利于后續(xù)的純化。構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒能夠在宿主體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，是驗(yàn)證蛋白互作的前提；同時(shí)，真核表達(dá)蛋白擁有多種翻譯后修飾功能，通常擁有與體內(nèi)相似的生物學(xué)活性，便于后續(xù)進(jìn)行其在宿主細(xì)胞中的功能研究。例如，很多真核細(xì)胞表達(dá)蛋白為分泌性的糖基化蛋白，避免了原核表達(dá)系統(tǒng)蛋白的變性復(fù)性，蛋白帶有糖基化修飾，更接近蛋白的天然結(jié)構(gòu)[9]，利于反映蛋白相互作用的真實(shí)情況。

本研究構(gòu)建了微小隱孢子蟲E2F樣結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因cpeld的原核和真核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-cpeld和p3XFLAG-CMV14-cpeld，同時(shí)構(gòu)建了可能與其互作的微小隱孢子蟲類鈣調(diào)蛋白編碼基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcmv-HA-CML，實(shí)現(xiàn)了cpeld基因的原核和真核表達(dá)、CML基因的真核表達(dá)，Western blot試驗(yàn)證實(shí)表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，為后續(xù)開(kāi)展CpELD、CpCML的互作關(guān)系驗(yàn)證，以及其特性和功能研究打下了基礎(chǔ)。