王 勃，王 忠，連 軍，周 蓓，呂曉敏，從美麗，趙效國

(新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，新疆烏魯木齊 830011)

實驗動物是生物醫(yī)學研究的基礎和重要支撐條件。近交系小鼠是科研實驗中最常用的實驗動物之一，但繁殖代數的增加，繁育條件的偏差，殘留的基因雜合及可能的基因突變會造成遺傳背景發(fā)生改變，導致實驗結果的差異，甚至出現(xiàn)錯誤的結果[1]。在較大規(guī)模飼養(yǎng)不同品系的近交系小鼠時，要保證品系的正確可靠，需對實驗動物進行遺傳學檢測。目前，用于監(jiān)測小鼠品系和遺傳特征的方法主要是免疫標記和生化標記等表型檢測方法，這些方法對于近緣品系(如各近交系的亞系)的近交系小鼠的區(qū)分能力不足，而且檢測的指標數量也有限[2]，因此實驗動物遺傳質量的檢測也從動物表型的研究漸漸趨向于對于 DNA 分子標記的探索，對小鼠基因組 DNA 序列的檢測是最直接有效的遺傳學鑒定方法，而且隨著基因檢測技術的進步，在 DNA 水平對實驗動物進行遺傳監(jiān)測也是大勢所趨[3-5]。

隨著生物醫(yī)學研究的不斷發(fā)展和深入，為滿足新疆地區(qū)教學科研對實驗動物的數量需求和質量要求，新疆醫(yī)科大學新建動物實驗中心通過驗收評審啟用，從上海斯萊克實驗動物有限責任公司重新引種繁育。在原有工作經驗基礎上，存在管理方式的改變和改進，以及飼養(yǎng)人員的變動。飼養(yǎng)繁育期間，曾出現(xiàn)過大小鼠脫毛的現(xiàn)象，通過改善飼料滅菌工藝和添加營養(yǎng)元素等方式，脫毛現(xiàn)象有所好轉[6]。但隨著繁殖代數增加，以及管理和飼養(yǎng)等因素的改變，是否存在遺傳基因突變的情況是未知的。因此，為進一步探究近交系小鼠的遺傳質量穩(wěn)定，該試驗通過二代測序技術，對生產群中的兩個品系(Balb/cByJ 和C57BL/6J)小鼠的112 個SNP位點進行了分型研究，確認所飼養(yǎng)繁育的實驗動物遺傳質量穩(wěn)定，為該地生物醫(yī)學研究數據結果的準確性與重復性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 2017年5月，Balb/cByJ和C57BL/6J兩個品系近交系小鼠引種自斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2017-0005]，飼養(yǎng)在新疆醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心屏障系統(tǒng)環(huán)境[SYXK(新)2018-0002]。2019年9月，選取16只6周齡左右SPF級小鼠，Balb/cByJ的雌雄各4只，分別標記為B♂1、B♂2、B♂3、B♂4、B♀1、B♀2、B♀3、B♀4，C57BL/6J的雌雄各4只，分別標記為C♂1、C♂2、C♂3、C♂4、C♀1、C♀2、C♀3、C♀4，剪取1 cm尾巴用于DNA提取，置于-20℃冰箱備用。

1.1.2 主要儀器 PCR擴增儀(T100)，美國Bio-Rad公司產品；電泳儀(EPS 300)，上海天能科技有限公司產品；全自動紫外與可見分析裝置(FR-200A)、生物電泳圖像分析系統(tǒng)(FR-980B)，上海復日科技有限公司產品；微量紫外分光光度計(NanoDrop)，美國ThermoFischer公司產品。

1.1.3 主要試劑 PCR 引物(PAGE 純化)，上海百力格生物技術有限公司產品；dNTP，上海有漁生物工程有限公司產品；PCR用Taq酶和緩沖液，該實驗室自制；動物基因組抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒，上海生工生物工程技術服務有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 小鼠DNA提取使用動物基因組抽提試劑盒按照說明書進行。以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA質量，用微量紫外分光光度計檢測濃度和質量后置于20℃冰箱保存。

1.2.2 多重PCR擴增目的片段 選取均勻分布于小鼠19條常染色體及X染色體上的112個SNP位點進行分型[7]，將112對引物等比例混合后稀釋成0.2 mol/L的儲存液備用。PCR反應體系(10 μL)包括:小鼠基因組DNA 15 ng～20 ng，20 mol/L dNTPs，10 mmol/L Mg2+，0.02 mol引物和0.5 U熱啟動Taq酶。按以下熱循環(huán)程序進行第一輪多重PCR擴增：95℃熱變性15 min；94℃ 30 s，60℃ 10 min,72℃ 30 s(4個循環(huán))；再進行94℃ 30 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s(24個循環(huán))。

1.2.3 第二輪PCR建庫 第一輪得到的產物稀釋10倍，用于第二輪建庫PCR的模板。在第二輪PCR體系(20 μL)包含：模板10 μL，引物0.04 μL，20 mol/L dNTPs，10 mmol/L Mg2+和 0.5 U熱啟動Taq酶，按照以下程序進行建庫PCR反應：95℃熱變性15 min；94℃ 30 s，60℃ 4 min,72℃ 30 s(5個循環(huán))，再進行94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 30 s(25個循環(huán))，72℃ 10 min。擴增結束后，將PCR產物進行電泳檢測，觀察電泳條帶是否均一，是否有雜帶等。

1.2.4 利用二代測序平臺進行SNP基因型檢測 將經建庫PCR擴增的文庫上樣電泳，電泳完畢后，割取目標片段，用凝膠回收試劑盒進行純化。純化產物精確定量并稀釋至測序所需濃度。建庫產物送蘇州金唯智生物科技有限公司，用安捷倫2200毛細管電泳儀質控后進行高通量測序，使用機型為Illumina X-10。

1.2.5 測序數據分析和SNP鑒定 測序得到的原始數據經Illumina bcl2fastq軟件轉化為序列數據，結果以 Fastq文件格式存儲。利用FASTQC[8]對原始序列進行質控，并根據條形碼序列分離出所有樣本。使用BWA(v0.7.12)和Samtools(v0.1.19)軟件[9]鑒定SNP位點。過濾小于15×測序深度位點，雜合子判定標準為等位基因的序列讀長比例在20%～80%。

2 結果

2.1 多重PCR產物的質量控制

30 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察二輪PCR產物的效果，確定每只小鼠樣本都擴增成功，主帶位于400 bp(圖1)，用凝膠回收試劑盒回收主帶。文庫純化后，以Agilent 2200對文庫進行質控，主峰位置400 bp，質控合格(圖2)。

M.DNA標準；1～16.B♀1、B♀2、B♀3、B♀4、B♂1、B♂2、B♂3、B♂4、C♀1、C♀2、C♀3、C♀4、C♂1、C♂2、C♂3、C♂4

圖2 Agilent 2200檢測結果

2.2 送檢小鼠的SNP檢測結果

對16只小鼠的112個SNP位點的擴增產物進行二代測序，得到有效讀取數為6 118 873，每個位點的平均讀取數為3 631，97個SNP位點在所有的小鼠中都被分型，另外15個SNP位點，至少在1只小鼠中沒有分型結果，被檢小鼠的這15個SNP的分型結果如圖3所示。15個SNP在被檢小鼠中的詳細分型結果見表1。rs13476971，rs3668927，rs3685276，rs3693131和rs3694100等5個SNP只在C57小鼠中被檢測出來，而rs13476630只在C57小鼠中被檢測，rs6373756雖然在15只小鼠中都被正確分型但是在Balb/c小鼠中的平均讀取數(4 272±1 404)遠大于C57小鼠(254±88)。另外，還發(fā)現(xiàn)有些SNP位點的檢測出現(xiàn)了性別偏差，比如，rs13484115和rs13484116只在雄鼠中被檢測，而雌鼠中沒有分型結果。

表1 未被全部檢出的15個SNP的檢測結果

圖3 不完全檢出的15個SNP在16只送檢小鼠中的分型結果

2.3 送檢小鼠的SNP分型結果

對所有送檢的16只小鼠進行SNP分型結果見表2，結果顯示，在檢出的SNP位點未出現(xiàn)雜合子現(xiàn)象。小鼠樣本的分型結果在Jackson數據庫中能找到與其分型完全匹配的品系，品系名稱為C57BL/6J或為Balb/cByJ。

表2 小鼠的SNP分型結果

3 討論

在近交系小鼠的保種和繁育生產過程中，雖有嚴格的要求，但仍存在著發(fā)生遺傳污染或遺傳漂變等風險。一個外源的動物與近交系的動物意外交配會導致近交系動物遺傳基因改變。這種類型的遺傳污染，會導致等位基因突然和大量交換，特別是在具有相似毛色的品系之間[10]。無品系間遺傳污染是近交系動物的基本要求，可通過定期開展生化標記檢測進行監(jiān)測。但同一品系動物在不同的地方獨立繁育，也會發(fā)生遺傳漂變產生亞系，可用分子遺傳標記檢測小鼠遺傳狀況。

隨著對實驗動物SNP檢測需求的不斷增加，用于遺傳鑒定的新的SNP檢測技術和手段也層出不窮。如施長根等[11]用熔解曲線法對小鼠單倍體細胞進行遺傳性別的鑒別；Zhang Jian等[12]用靶向SNP測序檢測了黃瓜的遺傳多樣性。我們通過多重靶向PCR結合二代測序[13]對近交系小鼠生產群中的16只小鼠進行了遺傳穩(wěn)定性的驗證，相較于其它傳統(tǒng)的形態(tài)學和免疫學等品系鑒定方法，這種SNP分型方法結果更為直觀可靠，而且性價比高、特異性強，而且多重靶向平臺用于SNP的分型已經得到了越來越廣泛的應用[14-15]。所選的112個SNP涵蓋了小鼠基因組的19條常染色體和1條性染色體(X染色體)，在近交系小鼠中具有較高的多態(tài)性，能夠鑒定所有的近交系小鼠品系。

盡管不是所有的SNP位點在16只小鼠中都有分型結果，但每只小鼠至少有100個以上的SNP位點得到了驗證，且均為純合子，與公布的品系一致。但我們也發(fā)現(xiàn)用二代測序對這些SNP位點的檢測有一些偏向性，比如有些SNP只在C57BL/6J或為Balb/cByJ中的一種品系的小鼠中被分型，而另一個品系的小鼠卻幾乎檢測不到讀取片段，而有的SNP位點在不同性別的小鼠中分型效率也存在很大差異。這些差異基本上是由第一輪多重PCR同時對112個SNP位點進行擴增時造成的，由于兩個不同品系的小鼠在每個SNP位點擴增的PCR產物有1個堿基的差異，可能會造成PCR擴增效率的輕微差異，如果是單重的PCR反應，這種差異幾乎不會對終產物造成可被觀察到的影響，而對于多重PCR反應而言，隨著反應的進行，多重反應之間的競爭會將輕微的擴增效率的差異不斷地擴大，導致最終有一種產物檢測不到[16]。

由于112個SNP位點是針對所有近交系小鼠品系設計的，對于某一個特定品系的小鼠定種的話，所需檢測的SNP數量會遠小于112個，因此在對這兩個品系小鼠進行遺傳質量鑒定時，并不要求所有112個SNP位點都有結果。通過分析該試驗得到的結果，已經足夠能鑒定出這16只Balb/cByJ和C57BL/6J小鼠都與其預期的品系一致。用多重靶向PCR結合二代測序技術進行SNP分型，能夠對近交系小鼠的遺傳特性進行快速準確的評估。