姜厚森 李忠 韓寧 趙陽 郭佳 吳培剛

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的退化性骨關(guān)節(jié)疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨慢性變性、關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙[1]。骨關(guān)節(jié)炎與炎癥反應(yīng)和基質(zhì)降解密切相關(guān)，特別是軟骨炎癥反應(yīng)與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展密切相關(guān)[2]。因此，靶向軟骨炎癥反應(yīng)和基質(zhì)降解是骨關(guān)節(jié)炎治療的有效方法。目前，非甾體類抗炎藥是臨床主要用于緩解骨關(guān)節(jié)炎患者疼痛和治療的有效藥物[3]。但非甾體類抗炎藥具有胃腸道等不良反應(yīng)，而且對(duì)軟骨基質(zhì)降解的影響較小。因此，開發(fā)同時(shí)具有抗炎和抗軟骨基質(zhì)降解活性的藥物是非常必要的。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)是存在于滑膜液和軟骨細(xì)胞中的重要促炎細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)分解代謝介質(zhì)和炎癥因子的產(chǎn)生。因此，IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞模型常被用于骨關(guān)節(jié)炎體外藥物和病理研究[4-5]。YSY-01A是化學(xué)合成的一種新型蛋白酶體抑制劑，可通過阻斷細(xì)胞周期殺傷腫瘤細(xì)胞，具有抗乳腺癌活性[6-7]。本研究觀察和探討了YSY-01A對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用和相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，72只，雄性，體質(zhì)量230～270 g，由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房內(nèi)。本研究符合濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物

YSY-01A，由濰坊醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成并提供，純度99%以上，溶解于DMSO溶液，配制成濃度0.01 mol/L，-20 ℃保存。

1.3 試劑

CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和β-actin一抗(Santa Cruz，美國)，COX-2一抗(Abcam，美國)，一氧化氮測量試劑盒(碧云天，中國)，前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)-3、MMP-13人ELISA試劑盒(R&D，美國)。

1.4 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)

人軟骨細(xì)胞(HC-A)購自Sigma公司(美國)，用含有10% FBS、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，于5% CO2和37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。體外將細(xì)胞分為NC組、IL-1β組、YSY-01A 6.2 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L組，用不同濃度的YSY-01A預(yù)處理細(xì)胞2 h，除對(duì)照組外，IL-1β(10 ng/mL)處理細(xì)胞24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞活力

根據(jù)CCK-8試劑盒制造商說明書測量，將軟骨細(xì)胞接種到96孔板(5 000個(gè)細(xì)胞/孔)中，并用不同濃度YSY-01A(0 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L)處理細(xì)胞24 h。然后，將10 μL CCK-8溶液加入軟骨細(xì)胞中并孵育2 h。最后，于波長450 nm處測量吸光度。

1.6 一氧化氮測量

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用NO測定試劑盒以硝酸還原酶法測定NO含量。最后，于波長550 nm處測量吸光度。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法

根據(jù)PGE2、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13人ELISA試劑盒制造商說明書測量軟骨細(xì)胞上清的含量。

1.8 蛋白免疫印跡(Western Blot)法

收集軟骨細(xì)胞，用含1 mmol/L PMSF和蛋白酶抑制劑混合物的蛋白裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，然后用BCA蛋白試劑盒測量蛋白濃度。將40 μg蛋白質(zhì)上樣SDS-PAGE凝膠電泳分離，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后與一抗(iNOS按1∶1 000稀釋；COX-2按1∶500稀釋；β-Actin按1∶1 000稀釋)于4 ℃孵育過夜，洗滌，并在室溫下二抗孵育2 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒曝光條帶。

1.9 骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、YSY-01A低劑量組(2.5 mmol/L)、YSY-01A中劑量組(5 mmol/L)、YSY-01A高劑量組(10 mmol/L)和陽性藥組(塞來昔布，2.86 mg/kg)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]，采用前交叉韌帶橫斷術(shù)建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停郝樽泶笫?約3.5%的異氟烷)，并于手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行關(guān)節(jié)囊切口和前交叉韌帶橫斷手術(shù)。手術(shù)后1周開始給藥治療，連續(xù)給藥4周，1周2次，共8次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集實(shí)驗(yàn)大鼠的血液和組織樣本。

1.10 體內(nèi)ELISA法

大鼠眼球取血，收集于1.5 mL EP管，室溫靜置30 min，3 000g下4 ℃離心10 min，收集上清，存儲(chǔ)于-80 ℃下，根據(jù)制造商說明測量大鼠血清中COX-2和PGE2含量。分離和定量稱取大鼠軟骨組織，收集于1.5 mL EP管，加入生理鹽水，組織研磨儀勻漿，10 000g下4 ℃離心15 min，收集上清，存儲(chǔ)于-80 ℃下，根據(jù)試劑盒說明書測量組織中iNOS活性和NO含量。

1.11 病理學(xué)觀察

收集實(shí)驗(yàn)大鼠右膝的脛骨樣本，置于中性福爾馬林中固定48 h，然后置于EDTA脫鈣液中脫鈣15 d，每3 d換1次液。石蠟包埋，用切片機(jī)切成5 μm薄片。用蘇木精-曙紅和番紅O-固綠染色，然后顯微鏡觀察軟骨和蛋白聚糖變性的變化并拍照。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 YSY-01A對(duì)軟骨細(xì)胞活力和炎癥介質(zhì)NO及PGE2的影響

用不同濃度YSY-01A(0 μmol/L、3.1 μmol/L、6.2 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L和100 μmol/L)處理軟骨細(xì)胞24 h，細(xì)胞活力檢測結(jié)果表明與NC組比較，50 μmol/L和100 μmol/L組細(xì)胞活力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1a)，故后續(xù)均采用6.2 μmol/L、12.5 μmol/L及25 μmol/L進(jìn)行試驗(yàn)。與NC組比較，IL-1β組細(xì)胞上清中NO和PGE2含量顯著升高，YSY-01A(6.2 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L)組細(xì)胞上清中NO和PGE2含量較IL-1β組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1b和c)。

注：F細(xì)胞活力=38.85，P細(xì)胞活力<0.001；FNO=162.0，PNO<0.001；FPGE2=249.9，PPGE2<0.001。a)與NC組比較，P<0.001；b)與IL-1β組比較，P<0.001。

2.2 YSY-01A對(duì)軟骨細(xì)胞iNOS和COX-2表達(dá)的影響

與NC組比較，IL-1β組細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，YSY-01A(6.2 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L)組細(xì)胞較IL-1β組iNOS和COX-2蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2a，b和c)。

注：FCOX-2=322.8，PCOX-2<0.001；FiNOS=169.5，PiNOS<0.001。a)與NC組比較，P<0.001；b)與IL-1β組比較，P<0.05；c)與IL-1β組比較，P<0.001。

2.3 YSY-01A對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥因子和金屬基質(zhì)蛋白酶的影響

與NC組比較，IL-1β組細(xì)胞上清TNF-α、IL-6、MMP-3和MMP-13含量顯著增加，YSY-01A(6.2 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L)組細(xì)胞較IL-1β組TNF-α、IL-6、MMP-3和MMP-13含量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖3a，b，c和d)。

注：FTNF-α=293.9，PTNF-α<0.001；FIL-6=83.18，PIL-6<0.001；FMMP-3=136.1，PMMP-3<0.001；FMMP-13=375.8，PMMP-13<0.001。a)與NC組比較，P<0.001；b)與IL-1β組比較，P<0.05；c)與IL-1β組比較，P<0.001。

2.4 YSY-01A對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨基質(zhì)降解的影響

與假手術(shù)組相比，在模型組中觀察到軟骨淺表破壞，軟骨侵蝕，大量蛋白聚糖損失和明顯的細(xì)胞減少，導(dǎo)致透明軟骨(HC)厚度減少和鈣化軟骨(CC)的增加。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不同劑量的YSY-01A導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨厚度顯著增加并改善了軟骨損傷，并增加透明軟骨厚度和減少鈣化軟骨(CC)，見圖4a和b。

圖4 YSY-01A對(duì)OA大鼠軟骨基質(zhì)降解的影響

2.5 YSY-01A對(duì)骨關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中COX-2和PGE2含量顯著增加，YSY-01A(低劑量，中劑量和高劑量)組較模型組大鼠血清中COX-2和PGE2含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5a和b)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠組織中iNOS和NO含量顯著增加，YSY-01A(低劑量，中劑量和高劑量)組較模型組大鼠組織中iNOS和NO含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5c和d)。

注：FCOX-2=113.5，PCOX-2<0.001；FPGE2=986.6，PPGE2<0.001；FiNOS=22.72，PiNOS<0.001；FNO=102.6，PNO<0.001。a)與假手術(shù)組比較，P<0.001；b)與模型組比較，P<0.05；c)與模型組比較，P<0.001。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是最普遍的關(guān)節(jié)疾病之一，炎癥反應(yīng)與骨關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)展密切相關(guān)。IL-1β、TNF-α和IL-6作為機(jī)體主要的促炎細(xì)胞因子，參與并介導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎病理中的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]。眾多細(xì)胞因子中IL-1β尤為重要，骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜液和軟骨細(xì)胞中存在大量的IL-1β。IL-1β可以誘導(dǎo)促炎介質(zhì)和炎癥因子的釋放，以及分解代謝介質(zhì)產(chǎn)生，如NO、MMP等[11]。IL-1β主要由軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞局部分泌，通過細(xì)胞表面受體和信號(hào)傳導(dǎo)途徑之間的相互作用加劇軟骨損傷[12]。此外，軟骨細(xì)胞作為軟骨組織唯一的細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，其功能障礙及代謝異常也可以加劇骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程[13]。研究發(fā)現(xiàn)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞通過產(chǎn)生和釋放MMP和炎癥因子引起細(xì)胞外基質(zhì)降解，可以體外模擬骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[14]。因此，IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞模型通常用于體外骨關(guān)節(jié)炎的病理和藥物干預(yù)研究[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)體外IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中炎癥介質(zhì)(COX-2、NO和PGE2)和促炎細(xì)胞因子(TNF-α和IL-6)含量增加，與之前研究一致，這說明本研究建立了骨關(guān)節(jié)炎體外模型。

NO作為一種重要的炎癥介質(zhì)，可以引起軟骨細(xì)胞凋亡，與骨關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)展密切相關(guān)。iNOS作為負(fù)責(zé)NO產(chǎn)生的酶，與NO在骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液中含量明顯增加，且MMP表達(dá)上調(diào)[16]。此外，NO誘導(dǎo)了包括MMP-3和MMP-13在內(nèi)的基質(zhì)降解酶的釋放[17]。本研究發(fā)現(xiàn)YSY-01A體外抑制IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中NO和iNOS的產(chǎn)生，同時(shí)體內(nèi)也能夠抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠組織的iNOS活性和NO含量。另外，炎癥因子TNF-α和IL-6是NO產(chǎn)生的促進(jìn)劑，參與骨關(guān)節(jié)炎的病理發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)YSY-01A也能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中炎癥因子TNF-α和IL-6產(chǎn)生。PGE2作為花生四烯酸環(huán)氧合酶代謝產(chǎn)物，是一種重要的促炎介質(zhì)。COX-2是機(jī)體內(nèi)PGE2生成的重要酶，非甾體抗炎藥主要通過抑制COX-2酶活性降低PGE2含量發(fā)揮抗炎活性。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)YSY-01A體外抑制了IL-1β誘導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生，并抑制了COX-2的表達(dá)。YSY-01A體內(nèi)也降低了骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清中PGE2和COX-2含量。這些結(jié)果說明YSY-01A在體內(nèi)外對(duì)骨關(guān)節(jié)炎均具有抗炎活性，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有潛在的治療價(jià)值。

除炎癥反應(yīng)外，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解也是骨關(guān)節(jié)炎的重要病理特征。軟骨細(xì)胞與軟骨修復(fù)、再生、體內(nèi)平衡和結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān)，軟骨細(xì)胞變性也是骨關(guān)節(jié)炎的主要原因之一[17]。多種炎癥因子刺激下，軟骨細(xì)胞從“靜止”狀態(tài)變?yōu)椤凹せ睢睜顟B(tài)，上調(diào)金屬蛋白酶MMP-3和MMP-13表達(dá)促進(jìn)了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加劇了骨關(guān)節(jié)炎的病理變化[18]。本研究發(fā)現(xiàn)YSY-01A體外抑制IL-1β誘導(dǎo)MMP-3和MMP-13釋放，這說明YSY-01A可能對(duì)軟骨基質(zhì)降解具有潛在活性。骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型主要包括部分或全部半月板切除、內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)、前十字韌帶和后十字韌帶橫斷術(shù)等模型[19]。骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型表現(xiàn)為疾病進(jìn)展快、而且成本低，研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后4周大鼠可表現(xiàn)出輕度的軟骨基質(zhì)破壞，故廣泛應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的藥物干預(yù)研究[20]。與體外研究一致，發(fā)現(xiàn)YSY-01A局部給藥能夠緩解骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨基質(zhì)降解，但具體機(jī)制不太清晰，仍需后續(xù)進(jìn)一步研究。這些結(jié)果均說明YSY-01A可以緩解軟骨基質(zhì)降解，對(duì)骨關(guān)節(jié)具有保護(hù)作用。

綜上所述，本研究表明YSY-01A可以同時(shí)抑制炎癥反應(yīng)和軟骨基質(zhì)降解，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎具有潛在的治療活性。但是，YSY-01A的抗炎和抗軟骨基質(zhì)降解的機(jī)制仍然不太清晰，需要進(jìn)一步探索。