徐萬蘇,柯 飛,許 怡,鄭 藝

徐萬蘇,衢州市人民醫(yī)院腫瘤放療科 浙江省衢州市 324000

柯飛,衢州市人民醫(yī)院病理科 浙江省衢州市 324000

許怡,鄭藝,衢州市人民醫(yī)院消毒供應(yīng)中心 浙江省衢州市 324000

0 引言

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤,發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第三位,死亡率居第四位嚴(yán)重威脅人類生命健康[1,2].目前,結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確且缺乏有效的治療藥物,探討其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,并尋找用于治療該腫瘤的藥物和分子靶點(diǎn)具有積極意義.藤梨根是獼猴桃科獼猴桃屬軟棗獼猴桃的根,具有清熱利濕、祛風(fēng)除痹、解毒消腫、止血的功效.近年來研究顯示,藤梨根提取物(rattan root extract,RRE)具有抗腫瘤功效,是腫瘤治療的潛在藥物.黨輝等[3]研究顯示,RRE可通過干預(yù)胃癌SGC7901細(xì)胞周期和凋亡抑制SGC7901細(xì)胞的增殖,發(fā)揮抗腫瘤作用.孫雪飛等[4]研究顯示,RRE可通過阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制人肺癌A549細(xì)胞生長.目前,RRE是否發(fā)揮抗結(jié)腸癌的作用還未知.微小RNA (microRNA,miRNA)可調(diào)控其靶基因的表達(dá),參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡等生命過程,可作為腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[5].研究顯示,miR-192-5p在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)降低,與腫瘤大小等臨床病理特征相關(guān),是結(jié)直腸癌診治的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[6,7].StarBase生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示,環(huán)腺苷酸調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白19(cAMP-regulated phosphoprotein 19,ARPP19)可能是miR-192-5p的靶基因.ARPP19可通過抑制蛋白磷酸酶2A來調(diào)節(jié)有絲分裂,其高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的惡性行為有關(guān)[8].因此,本研究以結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞為研究對象,miR-192-5p/ARPP19軸為切入點(diǎn),探討了RRE對SW480細(xì)胞增殖和凋亡及可能的分子機(jī)制,以期為結(jié)直腸癌的治療提供新途徑.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 RRE制備:藤梨根(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房)干燥后,粉碎,過200目篩.準(zhǔn)確稱取500 g藤梨根粉,加入2000 mL正丁醇,60 ℃回流24 h,過濾.濾渣再次回流,將兩次濾液合并,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇至膏狀,真空干燥后研磨至粉末.經(jīng)檢測提取物(RRE)主要成分為三萜類化合物.

1.1.2 細(xì)胞和試劑:SW480細(xì)胞系,中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基和四甲基噻唑藍(lán)(MTT),北京索萊寶;LipofectamineTM2000試劑盒,美國Invitrogen公司;鼠抗人細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)和活化的半胱天冬酶-3(C-caspase-3)抗體,美國Santa Cruz公司;重組人cAMP調(diào)節(jié)磷蛋白(ARPP19)抗體,南京萊富賽生物科技有限公司;PCR引物、miR-192-5p模擬物(mimics)和抑制劑(anti-miR-192-5p)及對照序列miR-NC和anti-miR-NC、ARPP19小干擾RNA(si-ARPP19)及亂序無意義陰性序列(si-NC),上海吉凱基因公司;Trizol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒,日本TAKARA公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒,二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒,上海碧云天.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:SW480細(xì)胞復(fù)蘇后,用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng).調(diào)整對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞濃度為2.5×104個/mL,以2.5 mL/孔接種于6孔板中.采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別轉(zhuǎn)染miR-192-5p mimics、miR-NC、anti-miR-192-5p、antimiR-NC、si-ARPP19、si-NC、anti-miR-192-5p與si-ARPP19、anti-miR-192-5p與si-NC.轉(zhuǎn)染12 h,更換培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞備用.

1.2.2 細(xì)胞分組:未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞分為對照組(NC組)和不同劑量RRE組,其中NC組細(xì)胞正常培養(yǎng);RRE組細(xì)胞分別用含50、100、200、400 μg/mL[3]RRE的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h.轉(zhuǎn)染miR-192-5p、miR-NC、si-ARPP19、si-NC的SW480細(xì)胞用不含RRE的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為miR-192-5p組、miR-NC組、si-ARPP19、si-NC組.轉(zhuǎn)染anti-miR-192-5p、anti-miR-NC、共轉(zhuǎn)染anti-miR-192-5p與si-ARPP19、anti-miR-192-5p與si-NC的SW480細(xì)胞均用含200 μg/mL RRE的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為,RRE+anti-miR-192-5p組、RRE+anti-miR-NC組、RRE+anti-miR-192-5p+si-ARPP19組、RRE+anti-miR-192-5p+si-NC組.

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖:調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105個/mL,以200 μL/孔接種于96孔板中.按1.3.2分組處理,培養(yǎng)后,加20 μL MTT (5 mg/mL).再孵育4 h,棄培養(yǎng)基,加150 μL二甲基亞砜,酶標(biāo)儀490 nm測吸光度值(A).存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對照組×100%.

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105個/mL,以1.0 mL/孔接種于24孔板中.按1.3.2分組處理,培養(yǎng)后,收集細(xì)胞,參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡.

1.2.5 RT-qPCR檢測細(xì)胞中miR-192-5p和ARPP19 mRNA水平:細(xì)胞接種和處理同1.3.4,培養(yǎng)結(jié)束后,Trizol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,行PCR擴(kuò)增.引物序列:miR-192-5p上游5’-GCCGCGGTACGTCGAGCAA-3’,下游5’-CCGTAGCCGAAGTAAAGTA-3’;ARPP19上游5’-GCCTGGAGGTTCAGATTTCTTA-3’,下游5’-CACCAGTGACCTCCGTCTTAT-3’;GAPDH上游5’-GCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGT-3’,下游5’-CACAGTCTTCTGGGTGGCA GTGA-3’;U6上游5’-TGTCCGTAGCTGAAACGACAC-3’,下游5’-CCGTAAAGCTGCCCG CTGACGC-3’.2－△△Ct法計(jì)算miR-192-5p相對于內(nèi)參U6、ARPP19 mRNA相對于內(nèi)參GAPDH的表達(dá)水平.

1.2.6 Western Blot法檢測ARPP19、CyclinD1和C-caspase-3蛋白表達(dá)水平:細(xì)胞接種和處理同1.2.4,培養(yǎng)結(jié)束后,RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白,經(jīng)BCA法定量、10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉后,分別加ARPP19(稀釋度1:500)、CyclinD1(稀釋度1:600)、C-caspase-3(稀釋度1:400)一抗體,4 ℃孵育過夜.加山羊抗兔二抗(稀釋度1:2000),室溫孵育1 h.加化學(xué)發(fā)光試劑,避光顯影后曝光拍照.

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):調(diào)整對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞濃度為2.5×104個/mL,以2.5 mL/孔接種于6孔板中.采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ARPP19與miR-192-5p mimic或miR-NC、MUTARPP19與miR-192-5p mimic或miR-NC.轉(zhuǎn)染12 h,更換培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞.參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明,檢測熒光素酶活性.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以mean±SD表示.兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn).以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 RRE對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響 與NC組比較,不同濃度(50、100、200、400 μg/mL)的RRE作用SW480細(xì)胞后,細(xì)胞存活率降低(P<0.05).由于200 μg/mL的RRE對SW480細(xì)胞抑制率接近50%,因此選擇RRE濃度為200 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).見表1.

2.2 RRE對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響 與NC組比較,200 μg/mL RRE作用SW480細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率、C-caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05).見圖1、表2.

2.3 RRE對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞miR-192-5p和ARPP19表達(dá)的影響 與NC組比較,200 μg/mL RRE作用SW480細(xì)胞后,細(xì)胞中miR-192-5p表達(dá)升高(P<0.05),ARPP19 mRNA和蛋白的表達(dá)降低(P<0.05).見圖2、表3.

2.4 miR-192-5p過表達(dá)對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組比較,miR-192-5p組SW480細(xì)胞中miR-192-5p表達(dá)升高(P<0.05),細(xì)胞存活率、CyclinD1蛋白表達(dá)降低(P<0.05),凋亡率、C-caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05).見圖3和表4.

2.5 抑制ARPP19表達(dá)對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較,si-ARPP19組SW480細(xì)胞中ARPP19蛋白表達(dá)降低(P<0.05),細(xì)胞存活率、CyclinD1蛋白表達(dá)降低(P<0.05),凋亡率、C-caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05).見圖4、表5.

表 1 MTT法檢測不同濃度藤梨根提取物對SW480細(xì)胞增殖的影響(mean±SD,n =9)

表 2 藤梨根提取物對SW480細(xì)胞凋亡的影響(mean±SD,n =9)

2.6 miR-192-5p負(fù)調(diào)控ARPP19表達(dá) ARPP19的3’UTR與miR-192-5p的連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)見圖5A.SW480細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-192-5p mimics與WT-ARPP19后熒光素酶活性降低(0.29±0.03比1.00±0.11,t=18.681,P<0.05),而共轉(zhuǎn)染miR-192-5p mimics與MUT-ARPP19后熒光素酶活性無顯著變化(1.07±0.12比1.06±0.10,t=0.192,P=0.850),說明miR-192-5p可與ARPP19的3’UTR靶向結(jié)合.與miR-NC組比較,miR-192-5p組SW480細(xì)胞中ARPP19蛋白水平降低(0.42±0.04比1.04±0.11,t=15.891,P<0.05),而與anti-miR-NC組比較,anti-miR-192-5p組SW480細(xì)胞中ARPP19蛋白水平升高(1.25±0.13比1.02±0.12,t=3.900,P<0.05),進(jìn)一步說明miR-192-5p靶向負(fù)調(diào)空ARPP19表達(dá).見圖5.

2.7 抑制miR-192-5p可逆轉(zhuǎn)RRE對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與RRE+anti-miR-NC組比較,RRE+anti-miR-192-5p組SW480細(xì)胞存活率、CyclinD1蛋白表達(dá)升高(P<0.05),凋亡率、C-caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05).見圖6和表6.

2.8 抑制ARPP19可以逆轉(zhuǎn)抑制miR-192-5p對RRE處理的結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與RRE+anti-miR-192-5p+si-NC組比較,RRE+anti-miR-192-5p+si-ARPP19組SW480細(xì)胞存活率、CyclinD1蛋白表達(dá)降低(P<0.05),凋亡率、C-caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05).見圖7和表7.

表 3 藤梨根提取物對SW480細(xì)胞中miR-192-5p和ARPP19表達(dá)的影響(mean±SD,n =9)

表 4 miR-192-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響(mean±SD,n =9)

表 5 抑制ARPP19表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響(mean±SD,n =9)

表 6 抑制miR-192-5p可逆轉(zhuǎn)藤梨根提取物對SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響(mean±SD,n =9)

3 討論

結(jié)直腸癌的治療通常輔助化療、放療等治療,但化療藥物通常存在較大的副作用,且療效不佳[9].近年來,中藥及其活性成分因毒副作用小、藥效強(qiáng),其在腫瘤治療中的作用備受關(guān)注.RRE是從中藥藤梨根提取而來,研究顯示,RRE可能通過胃癌SGC-7901細(xì)胞Bcl-2蛋白水平的表達(dá)促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡[10];RRE可通過抑制PI3K/Akt通路的激活抑制人肺癌細(xì)胞A549增殖.這說明RRE具有抗腫瘤的作用.Caspase級聯(lián)反應(yīng)參與調(diào)控細(xì)胞凋亡,而caspase-3是caspase級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控蛋白,其活化后剪切下游分子,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11].本研究顯示,RRE作用SW480細(xì)胞后,細(xì)胞存活率降低,而凋亡率及細(xì)胞中C-caspase-3蛋白表達(dá)升高,表明RRE可能通過調(diào)控caspase級聯(lián)反應(yīng)來抑制SW480細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用.

miR-192-5p是一種miRNA,參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展.Zhu等[12]研究顯示,miR-192-5p在肝癌組織中表達(dá)降低,過表達(dá)miR-192-5p通過靶向甲狀腺激素受體相互作用因子13對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲發(fā)揮抑制作用,而對其上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化起促進(jìn)作用,為肝癌的治療提供了新的作用靶點(diǎn).Zou等[13]研究顯示,miR-192-5p在胰腺癌組織和患者血清表達(dá)上調(diào),血清miR-192-5p可用于胰腺癌的早期診斷.這說明miR-192-5p在不同腫瘤中發(fā)揮的作用不同,即可作為抑癌基因抑制腫瘤發(fā)展進(jìn)程,又可作為促癌基因促進(jìn)腫瘤發(fā)展進(jìn)程.吳巍蕓等[14]研究顯示,過表達(dá)miR-192可抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的遷移和侵襲.本研究顯示,轉(zhuǎn)染miR-192-5p mimics對阻礙SW480細(xì)胞增殖,并加劇其凋亡,提示miR-192-5p在結(jié)直腸癌中起抑癌基因作用,其可能是結(jié)直腸癌治療的分子靶點(diǎn).Jin等[15]研究顯示,姜黃素可通過上調(diào)miR-192-5p表達(dá)減弱非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖能力及促進(jìn)細(xì)胞凋亡.本研究顯示顯示,RRE可促進(jìn)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中miR-192-5p表達(dá),抑制miR-192-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了RRE對SW480細(xì)胞增殖、凋亡及CyclinD1和C-caspase-3蛋白表達(dá)的影響,說明RRE通過上調(diào)細(xì)胞中miR-192-5p表達(dá)發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用.

表 7 抑制ARPP19可以逆轉(zhuǎn)抑制miR-192-5p對藤梨根提取物處理的SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響(mean±SD,n =9)

圖 1 藤梨根提取物(rattan root extract,RRE)對SW480細(xì)胞凋亡的影響.A:流式細(xì)胞儀檢測RRE對SW480細(xì)胞凋亡的影響;B:RRE對SW480細(xì)胞中C-caspase-3蛋白表達(dá)的影響.

圖 2 藤梨根提取物對SW480細(xì)胞中ARPP19蛋白表達(dá)的影響.

為了進(jìn)一步探討RRE通過上調(diào)細(xì)胞中miR-192-5p表達(dá)發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用的機(jī)制,本研究還證實(shí)了miR-192-5p在SW480細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控ARPP19表達(dá).研究顯示,甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中ARPP19表達(dá)升高,上調(diào)miR-26a通過靶向抑制ARPP19阻礙甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖[16];ARPP19表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌腫瘤大小成正比,抑制ARPP19表達(dá)可降低肝細(xì)胞癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721的生長速率[17];抑制miR-320表達(dá)通過上調(diào)ARPP19促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長[18].目前,ARPP19在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用還未知.本研究顯示,抑制ARPP19表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,說明ARPP19作為促癌基因參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展,抑制其表達(dá)可有效緩解結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程,對改善患者預(yù)后有積極幫助.本研究還顯示,RRE可抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中ARPP19表達(dá),抑制ARPP19表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-192-5p表達(dá)對RRE處理的SW480細(xì)胞增殖、凋亡及CyclinD1和C-caspase-3蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)一步說明RRE通過上調(diào)細(xì)胞中miR-192-5p表達(dá),進(jìn)而下調(diào)ARPP19表達(dá)發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用.

圖 3 miR-192-5p過表達(dá)后SW480細(xì)胞凋亡及CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá).A:流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞miR-192-5p過表達(dá)后SW480細(xì)胞凋亡;B:Western blot檢測miR-192-5p過表達(dá)后SW480細(xì)胞中CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá).

圖 4 抑制ARPP19表達(dá)后SW480細(xì)胞凋亡及細(xì)胞中ARPP19、CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá).A:流式細(xì)胞儀檢測抑制ARPP19表達(dá)后SW480細(xì)胞凋亡;B:Western blot檢測抑制ARPP19表達(dá)后SW480細(xì)胞中ARPP19、CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá).

圖 5 miR-192-5p靶向調(diào)控ARPP19的表達(dá).A:通過TargetScan對miR-192-5p和ARPP19結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖;B:Western blot檢測ARPP19蛋白的表達(dá).

4 結(jié)論

綜上,RRE可阻礙結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖,而誘導(dǎo)其凋亡,作用機(jī)制可能與調(diào)控miR-192-5p/ARPP19軸有關(guān),具有治療結(jié)直腸癌的潛在價(jià)值.本研究接下來將通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討RRE對體內(nèi)結(jié)腸癌腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響及其他作用機(jī)制,以期為其用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

圖 6 抑制miR-192-5p可逆轉(zhuǎn)RRE對SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響.A:流式細(xì)胞儀檢測抑制miR-192-5p對RRE處理的SW480細(xì)胞凋亡的影響;B:Western blot檢測抑制miR-192-5p對RRE處理的SW480細(xì)胞中CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá)的影響.

圖 7 抑制ARPP19可以逆轉(zhuǎn)抑制miR-192-5p對藤梨根提取物(rattan root extract,RRE)處理的SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響.A:流式細(xì)胞儀檢測抑制ARPP19和miR-192-5p對RRE處理的SW480細(xì)胞凋亡的影響;B:Western blot檢測抑制ARPP19和miR-192-5p對RRE處理的SW480細(xì)胞中ARPP19、CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達(dá)的影響.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確,且缺乏有效的治療藥物.藤梨根提取物(rattan root extract,RRE)具有一定抗胃癌和肺癌作用,但其是否影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展還未知.本研究探究RRE對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能機(jī)制,以期為結(jié)直腸癌的治療提供新途徑.

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

本研究的主題是RRE是否影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡及其能否調(diào)控miR-192-5p/ARPP19軸發(fā)揮作用,目前是為了探究RRE是否發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用及其可能的作用機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究的主要目標(biāo)是探討RRE是否具有抗結(jié)直腸癌作用及其可能的作用機(jī)制,通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確RRE可能通過調(diào)控miR-192-5p/ARPP19軸抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,以期為其用于結(jié)直腸癌的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

實(shí)驗(yàn)方法

本研究采用MTT檢測細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞中CyclinD1、C-caspase-3和ARPP19蛋白水平,RT-qPCR檢測細(xì)胞中miR-192-5p和ARPP19 mRNA水平.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-192-5p和ARPP19靶向調(diào)控關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究結(jié)果表明RRE可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,并促進(jìn)其凋亡,在一定程度上發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用.同時(shí),RRE促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-192-5p表達(dá)而抑制ARPP19表達(dá).過表達(dá)miR-192-5p或抑制ARPP19均可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,且miR-192-5p靶向負(fù)調(diào)控ARPP19.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究首次發(fā)現(xiàn)RRE可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,并加劇細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與調(diào)控miR-192-5p/ARPP19軸有關(guān),具有治療結(jié)直腸癌的潛在價(jià)值.

展望前景

本研究存在不足之處,僅在體外細(xì)胞層面進(jìn)行了探究,尚未通過動物實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)探究RRE的抗結(jié)直腸癌作用,接下來將通過裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證RRE對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及潛在機(jī)制,以期為結(jié)直腸癌的治療提供新途徑.