王 沁,龔黎明,鄭 惠

王沁,金華市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科 浙江省金華市 321000

龔黎明,鄭惠, 蘭溪市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 浙江省蘭溪市 321100

0 引言

流行病學(xué)調(diào)查顯示,結(jié)直腸癌發(fā)病率居我國(guó)全身惡性腫瘤的第4位,并隨生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)改變逐漸增長(zhǎng)與年輕化[1,2].手術(shù)切除是結(jié)直腸癌主要治療手段,但Ⅱ-Ⅲ期患者手術(shù)切除后仍存在較大復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),故術(shù)后實(shí)施輔助化療十分必要[3].然而相關(guān)研究顯示[4,5],結(jié)直腸癌手術(shù)可破壞正常腸道菌群,誘導(dǎo)腸道菌群易位,進(jìn)而增加術(shù)后全身炎癥反應(yīng)綜合征發(fā)生率,且化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞造成不同程度損害,進(jìn)而增加毒副反應(yīng)發(fā)生率.有學(xué)者指出,酪酸梭菌活菌片屬益生菌,可直接補(bǔ)充因化療或手術(shù)所致機(jī)體欠缺的生理細(xì)菌,調(diào)節(jié)腸道菌群系統(tǒng),增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[6,7],但關(guān)于其與FOLFOX4方案化療聯(lián)合對(duì)結(jié)直腸癌免疫炎癥、腸道菌群的影響缺乏相關(guān)研究.基于此,本研究首次嘗試分析酪酸梭菌活菌片聯(lián)合亞葉酸鈣+氟尿嘧啶+奧沙利鉑(folinate 5-fluorouracil oxaliplatin,FOLFOX4)方案化療對(duì)結(jié)直腸癌術(shù)后腸道菌群平衡、毒副反應(yīng)及免疫炎癥指標(biāo)的影響.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2017-04/2020-05我院結(jié)直腸癌術(shù)后患者92例,納入標(biāo)準(zhǔn):(1)結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照《2016 USPSTF建議聲明:結(jié)直腸癌篩查》[8],并均經(jīng)腸鏡、腹部CT或病理組織學(xué)檢查確診;(2)均符合手術(shù)適應(yīng)證;(3)預(yù)計(jì)生存期＞3 mo;排除標(biāo)準(zhǔn):(1)存在手術(shù)禁忌證者;(2)合并原發(fā)性慢性腸炎、炎癥性腸病及腸易激綜合征等疾病者;(3)伴有急性腸梗阻、穿孔者;(4)術(shù)中發(fā)現(xiàn)腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn),無法實(shí)施手術(shù)切除者;(5)近4 wk內(nèi)有微生態(tài)制劑、免疫抑制劑等藥物使用史者;(6)合并肝腎等其他重要臟器器質(zhì)性功能損害者;(7)處于妊娠期、產(chǎn)褥期或哺乳期等特殊時(shí)期者;(8)患有慢性炎癥感染性疾病者;(9)意識(shí)不清或精神欠佳者.簡(jiǎn)單隨機(jī)化法分為研究組(n＝ 46)、對(duì)照組(n＝ 46).本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有研究對(duì)象均簽署知情同意書.

1.2 方法 兩組均實(shí)施手術(shù)治療,術(shù)后均密切觀察患者生命體征,并予以營(yíng)養(yǎng)支持、抗感染、鎮(zhèn)痛等對(duì)癥處理.

1.2.1 對(duì)照組:根據(jù)患者病情恢復(fù)情況在術(shù)后14 d內(nèi)采用FOLFOX4方案化療治療,即d1,靜脈滴注奧沙利鉑(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20143263,規(guī)格:50 mg)85 mg/m2,時(shí)間為120 min;d1-2,靜脈滴注亞葉酸鈣[江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20060197,規(guī)格:100 mg(按亞葉酸計(jì))]200 mg/m2,時(shí)間為120 min,靜脈滴注完畢后,靜脈注射5-氟尿嘧啶(吉林通化茂祥制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H22023469,規(guī)格:10 mL:0.25g)400 mg/m2,后改為靜脈滴注600 mg/m2,時(shí)間為4 h.

1.2.2 研究組:在對(duì)照組基礎(chǔ)上術(shù)后第1 d起口服酪酸梭菌活菌片(青島東海藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字S20040083,規(guī)格:每片350 mg,含酪酸梭菌活菌片數(shù)不低于1.5×107CFU/g),700 mg/次,3次/d.兩組均以2 wk為1個(gè)療程,持續(xù)治療8 wk.

1.2.3 檢測(cè)方法:(1)空腹取9 mL肘靜脈血:①通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平,嚴(yán)格參照常州必達(dá)科生物科技有限公司提供的儀器說明書操作;②加入8%高氯酸(2 mL)混勻,采用酶學(xué)分光光度法測(cè)定血漿D乳酸,嚴(yán)格參照上海必優(yōu)生物科技有限公司提供的試劑盒說明書操作;③1000×g離心15 min(離心半徑8 cm),分離取血清,置于-20 ℃低溫保存,利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清糖類抗原724(carbohydrate antigen724,CA724)、糖類抗原199(carbohydrate antigen199,CA199)、癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin,IL-6)水平,運(yùn)用免疫比濁法測(cè)定血清C反應(yīng)蛋白(CRP)水平,嚴(yán)格參照南京澤維爾生物科技有限公司提供的試劑盒說明書操作.(2)取0.5 g新鮮糞便,添加生理鹽水(0.9%),持續(xù)稀釋10倍至10-9,分別取0.5 mL 10-1、10-3、10-5、10-7、10-9稀釋液,對(duì)糞腸球菌、大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌進(jìn)行培養(yǎng),分別接種于羊血平板培養(yǎng)基、蘭瓊脂平板培養(yǎng)基、MRS營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基與BS血瓊脂平板培養(yǎng)基,其中糞腸球菌、大腸桿菌放置于35 ℃孵箱培養(yǎng)1 d,乳酸桿菌、雙歧桿菌以抽氣換氣培養(yǎng)法培養(yǎng)2 d,計(jì)算每克糞便濕重中菌落形成單位(CFU)的對(duì)數(shù)值[9].(3)取新鮮糞便0.5 g,根據(jù)1:3比例稀釋混勻生理鹽水,2500 r/min離心15 min,去上清液過濾,運(yùn)用透射比濁法測(cè)定糞便分泌型免疫球蛋白A(SIgA)水平,嚴(yán)格參照上海名典生物工程有限公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作.

1.3 觀察指標(biāo) (1)比較兩組一般資料;(2)比較兩組治療前、治療8 wk后血清腫瘤標(biāo)志物,即CA724、CA199、CEA水平;(3)比較兩組治療前、治療8 wk后免疫功能指標(biāo),即CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平;(4)比較兩組治療前、治療8 wk后血清炎癥反應(yīng)指標(biāo),即TNF-α、CRP、IL-6水平;(5)比較兩組治療前、治療8 wk后腸道菌群指標(biāo),包括糞腸球菌、大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量;(6)比較兩組治療前、治療8周后腸道屏障功能指標(biāo),即血漿D乳酸、糞便S-IgA水平;(7)統(tǒng)計(jì)兩組毒副反應(yīng),包括惡心嘔吐、肢端麻木、白細(xì)胞減少、肝功能異常、血小板減少.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料采取巴特利(Bartlett)方差齊性檢驗(yàn)與科爾莫戈羅夫·斯米爾諾夫(Kolmogorov-Smirnov)正態(tài)性檢驗(yàn),均確認(rèn)具備方差齊性且近似服從正態(tài)布,以mean±SD描述,t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料用n(%)表示、χ2檢驗(yàn).P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 一般資料 兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、病程、腫瘤部位、Dukes分期、分化程度、手術(shù)方式比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1.

2.2 血清腫瘤標(biāo)志物水平 兩組治療前血清CA724、CA199、CEA水平相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組治療8 wk后血清CA724、CA199、CEA水平較治療前降低,且研究組低于對(duì)照組(P＜0.05).見表2.

2.3 免疫功能指標(biāo) 兩組治療前CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;研究組治療8 wk后CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平與治療前相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,研究組治療8 wk后CD4+、CD4+/CD8+水平高于對(duì)照組,CD8+水平低于對(duì)照組(P＜0.05).見表3.

2.4 血清炎癥反應(yīng)指標(biāo) 兩組治療前血清TNF-α、CRP、IL-6水平相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組治療8 wk后血清TNF-α、CRP、IL-6水平較治療前降低,且研究組低于對(duì)照組(P＜0.05).見表4.

2.5 腸道菌群指標(biāo) 兩組治療前糞腸球菌、大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組治療8 wk后糞腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量較治療前提高,且研究組高于對(duì)照組,大腸桿菌數(shù)量較治療前降低,且研究組低于對(duì)照組(P＜0.05).見表5.

2.6 腸道屏障功能指標(biāo) 兩組治療前血漿D乳酸、糞便S-IgA水平相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組治療8 wk后血漿D乳酸水平較治療前降低,且研究組低于對(duì)照組,糞便S-IgA水平較治療前提高,且研究組高于對(duì)照組(P＜0.05).見表6.

2.7 毒副反應(yīng) 研究組惡心嘔吐、肢端麻木、白細(xì)胞減少、肝功能異常發(fā)生率低于對(duì)照組(P＜0.05);兩組血小板減少發(fā)生率相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.見表7.

3 討論

FOLFOX4方案化療是結(jié)直腸癌術(shù)后常用化療方案,可有效抑制機(jī)體癌細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移,減輕患者臨床癥狀,延長(zhǎng)患者生存周期[10],但其易引發(fā)惡心嘔吐、肝功能異常、免疫功能低下等毒副反應(yīng),影響患者生存質(zhì)量.因此,如何增強(qiáng)結(jié)直腸癌術(shù)后化療患者抗腫瘤免疫應(yīng)答水平、降低毒副反應(yīng)發(fā)生率是目前臨床亟需解決的問題.

CA724、CA199、CEA是臨床常用腫瘤標(biāo)志物,其在結(jié)直腸癌患者中過度高表達(dá),與療效、腫瘤臨床分期、復(fù)發(fā)存在相關(guān)性[11-13].迪米拉·阿里根等[14]研究發(fā)現(xiàn),在XELOX方案化療治療的同時(shí)聯(lián)合雙歧桿菌三聯(lián)活菌,能有效降低結(jié)直腸癌術(shù)后腫瘤標(biāo)志物水平,增強(qiáng)化療抗腫瘤療效.在此基礎(chǔ)上,本研究首次于結(jié)直腸癌術(shù)后采用酪酸梭菌活菌片聯(lián)合FOLFOX4方案化療治療,結(jié)果顯示,二者聯(lián)合能有效減少患者血清CA724、CA199、CEA水平,這可能是由于二者聯(lián)合能發(fā)揮良好協(xié)同增效減毒作用,刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞成熟,雙向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能,抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而降低血清腫瘤標(biāo)志物水平,實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用.

同時(shí),有學(xué)者指出[15,16],結(jié)直腸癌術(shù)后大腸桿菌數(shù)量明顯增加,雙歧桿菌與大腸桿菌比例下調(diào),易破壞腸道原有腸黏膜生物屏障功能,明顯改變腸道通透性,而腸黏膜屏障損壞則會(huì)進(jìn)一步加重原有腸道微生態(tài)紊亂,最終形成惡性循環(huán),加重患者病情.血漿D乳酸、糞便S-lgA是評(píng)估腸道黏膜屏障功能常用指標(biāo),其中血漿D乳酸是腸道固有細(xì)菌代謝物,隨腸道黏膜屏障損傷程度加重,其含量明顯增加[17];糞便S-lgA是腸黏膜主要免疫球蛋白,也是腸黏膜防御的重要組成部分[18].另外,一項(xiàng)大鼠實(shí)驗(yàn)表明[19],高劑量復(fù)合益生菌可增加腸道乳桿菌、雙歧桿菌含量,調(diào)節(jié)腸道菌群.本研究數(shù)據(jù)表明,酪酸梭菌活菌片聯(lián)合FOLFOX4方案化療對(duì)糾正結(jié)直腸癌術(shù)后患者腸道菌群紊亂、修復(fù)受損腸黏膜屏障功能具有一定積極效應(yīng),與李灼非等[20]研究相似,這可能是由于酪酸梭菌活菌片劑量大,可提供充足有益菌,有效防止致病菌繁殖,恢復(fù)腸道菌群平衡,并可促進(jìn)酪酸分解,分泌抗氧化、抗癌化合物短鏈脂肪酸,為腸道黏膜修復(fù)提供能量[21],與FOLFOX4方案化療聯(lián)合,通過生物奪氧功能,不僅能降低腸道定植部位氧濃度,調(diào)節(jié)厭氧菌群生長(zhǎng)環(huán)境,維持腸道菌群平衡,還能改善腸道通透性,抑制D乳酸滲透入血及S-IgA流失,從而有效保護(hù)腸道黏膜屏障功能.

受手術(shù)治療創(chuàng)傷、術(shù)中失血及麻醉等因素影響,結(jié)直腸癌患者術(shù)后處于應(yīng)激狀態(tài),可能影響細(xì)胞免疫功能,引發(fā)繼發(fā)性免疫功能缺陷,加之結(jié)直腸癌患者腸道菌群紊亂,腸道黏膜屏障功能損害,進(jìn)一步抑制機(jī)體免疫應(yīng)答[22,23].本研究通過對(duì)比研究可知,研究組治療8 wk后CD4+、CD4+/CD8+水平高于對(duì)照組,CD8+水平低于對(duì)照組,提示酪酸梭菌活菌片聯(lián)合FOLFOX4方案化療能有效調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌術(shù)后患者免疫功能,結(jié)合既往研究[24]分析可能與酪酸梭菌活菌片能糾正腸道菌群紊亂,維持腸黏膜屏障功能完整性有關(guān).同時(shí),結(jié)直腸癌患者大腸桿菌等致病菌異常增殖,會(huì)釋放大量?jī)?nèi)毒素及細(xì)菌毒素,刺激肝巨噬細(xì)胞及其他相關(guān)炎癥細(xì)胞,進(jìn)而持續(xù)分泌TNF-α、CRP、IL-6等炎癥因子,提高感染并發(fā)癥發(fā)生率[25].本研究數(shù)據(jù)表明,酪酸梭菌活菌片聯(lián)合FOLFOX4方案化療在降低結(jié)直腸癌術(shù)后患者炎癥反應(yīng)

方面優(yōu)于單純FOLFOX4方案化療治療,這可能是由于酪酸梭菌活菌片通過外源性補(bǔ)充雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌,減少腸內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素移位,抑制炎癥因子分泌,與FOLFOX4方案化療聯(lián)合,可激活吞噬細(xì)胞活性,刺激腸道局部免疫反應(yīng),增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力,從而減輕炎癥反應(yīng).進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn),酪酸梭菌活菌片聯(lián)合FOLFOX4方案化療能有效降低惡心嘔吐、肢端麻木、白細(xì)胞減少、肝功能異常發(fā)生率,可能與酪酸梭菌活菌片能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,減輕神經(jīng)系統(tǒng)毒性,調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)有關(guān).

表 1 兩組一般資料比較

表 2 兩組血清腫瘤標(biāo)志物水平比較(mean±SD)

表 3 兩組免疫功能指標(biāo)比較(mean±SD)

表 4 兩組血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較(mean±SD)

表 5 兩組腸道菌群指標(biāo)比較(mean±SD,lg CFU/g)

表 6 兩組腸道屏障功能指標(biāo)比較(mean±SD)

表 7 兩組毒副反應(yīng)比較n (%)

4 結(jié)論

綜上可知,酪酸梭菌活菌片聯(lián)合FOLFOX4方案化療通過糾正腸道菌群紊亂,修復(fù)受損腸黏膜屏障功能,有助于調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌術(shù)后患者免疫炎癥反應(yīng),降低血清腫瘤標(biāo)志物水平,減少毒副反應(yīng).但本研究也存在一定不足,如涉及樣本量較小,所得結(jié)論僅是初步的;未探討其他益生菌是否有類似作用;缺少腸道菌群測(cè)序等,應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,采取多中心、深層次研究方法從微生物組學(xué)角度進(jìn)行深度且全面分析,以便為研究結(jié)果提供理論與數(shù)據(jù)支撐.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

結(jié)直腸癌患者一旦進(jìn)入中晚期,除了手術(shù)治療外,還需要化療藥物進(jìn)行術(shù)后的輔助治療,化療藥物對(duì)身體免疫系統(tǒng)的破壞是比較明顯的,且本身結(jié)直腸癌患者的消化功能也較差,因此能夠增強(qiáng)腸道的吸收,進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫的輔助治療就顯得尤為重要.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究從化療藥物對(duì)身體的影響和結(jié)直腸癌患者腸道吸收能力較差的角度出發(fā),擬減輕化療對(duì)身體免疫系統(tǒng)的破壞,同時(shí)能夠增強(qiáng)腸道的吸收能力,保證機(jī)體能夠正常運(yùn)轉(zhuǎn),對(duì)結(jié)直腸癌患者的術(shù)后的恢復(fù)起到積極的作用.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究旨在利用酪酸梭菌活菌片中有益菌改善腸道微生態(tài)條件改善由于結(jié)直腸癌的影響較差的腸道吸收功能,同時(shí)改善由于化療藥物的影響而造成的免疫功能的下降,為結(jié)直腸癌術(shù)后治療提供有益于機(jī)體健康,毒副作用小的微生物療法.

實(shí)驗(yàn)方法

本研究主要采用了用藥后對(duì)各個(gè)指標(biāo)檢測(cè)、觀察和分析的方法,通過對(duì)腸道菌群的檢測(cè),和對(duì)免疫相關(guān)指標(biāo)的分析,從微環(huán)境和蛋白分子水平來判斷酪酸梭菌活菌片對(duì)術(shù)后患者的作用效果.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

治療后,與對(duì)照組相比,研究組的血清C A724、CA199、CEA、CD8+、TNF-α、CRP、IL-6水平、大腸桿菌數(shù)量、血漿D乳酸水平更低,CD4+、CD4+/CD8+水平、糞腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量、糞便S-IgA水平更高.研究組的不良事件發(fā)生率低于對(duì)照組.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

酪酸梭菌活菌片改善了結(jié)直腸癌患者腸道菌群的結(jié)構(gòu),增加了有益菌群的數(shù)量,降低了炎癥因子的表達(dá),促進(jìn)了免疫功能的提升且無毒副作用,為進(jìn)一步改善患者的生活質(zhì)量提供了一種健康價(jià)廉的高效治療方案.

展望前景

本研究樣本僅限于我院收集的,多為本地區(qū)及周圍的人群,數(shù)量相對(duì)較少,是否能夠涵蓋更廣的人群還有待于進(jìn)一步收集更多更廣的樣本量.腸道菌群較為復(fù)雜多樣,其他相關(guān)菌群是否有影響沒有探討,后續(xù)將采用高通量測(cè)序等技術(shù)從微生物組學(xué)角度進(jìn)行全面的分析,為研究結(jié)果提供更可靠的理論與數(shù)據(jù)支撐.