郭佳，許珂，殷姜文，葛明月，秦新磊，樊世文，張晗，李燕*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832000;2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆 石河子 832000)

隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，全身麻醉在手術(shù)患者中的應(yīng)用越來越普遍，但全身麻醉在蘇醒期間仍存在諸多的并發(fā)癥，如圍術(shù)期神經(jīng)認知紊亂、術(shù)后低血壓、術(shù)后低氧血癥、誤吸等，蘇醒延遲更是增加了其發(fā)生的概率。全身麻醉的機制目前尚不明確，有研究表明全身麻醉狀態(tài)與自然睡眠具有相似的腦電圖改變及特定部位腦功能變化[1]。經(jīng)典的覺醒通路包括：膽堿能通路、食欲素能通路、組胺能通路、去甲腎上腺素能通路和多巴胺能通路[2]。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)是睡眠覺醒相關(guān)最重要的核團之一[3]，目前鮮有研究，該核團內(nèi)含有大量多巴胺能神經(jīng)元并接受來自下丘腦腹外側(cè)視前核(ventrolateral preoptic nucleus,VLPO)及中縫背核(dorsal raphe nucleus，DR)的投射，經(jīng)典研究已證實VTA與吸入麻醉蘇醒相關(guān)，可能原因是VTA內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元可將神經(jīng)纖維投射至前額葉皮層(Prefrontal cortex,PFC)、伏隔核(nucleus accumben，NAc)等覺醒相關(guān)部位[4]。多巴胺轉(zhuǎn)運體(DAT)作為特異性分布在多巴胺能神經(jīng)元表面的跨膜蛋白，其變化是否對丙泊酚全麻蘇醒產(chǎn)生影響尚不明確。因此，本研究選用經(jīng)典麻醉藥丙泊酚，通過構(gòu)建一個slc6a3基因敲低DAT的腺相關(guān)病毒來探討VTA區(qū)DAT在丙泊酚全麻蘇醒中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g。為觀察VTA在丙泊酚麻醉中的作用，將20只大鼠隨機分為2組：對照組(Negative control,NC)、6-OHDA毀損組(6-OHDA)，每組10只。為觀察丙泊酚麻醉對VTA內(nèi)DAT的影響，將20只大鼠隨機分為2組：生理鹽水組(Saline，S)、丙泊酚麻醉組(Propofol,P)，每組10只。其余實驗部分將30只大鼠隨機分為3組：對照組(Negative control,NC)、AAV空載組(AAV·NC)、AAV2·DAT·RNAi組(AAV)，每組10只。為觀察丙泊酚對前額葉皮層(PFC)c-fos蛋白表達的影響，免疫熒光及Western blot實驗部分另添加生理鹽水注射組(Saline，S)和丙泊酚麻醉組(Propofol,P)兩個亞分組，每組10只。實驗動物均由新疆實驗動物中心提供，喂養(yǎng)環(huán)境為石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗動物房。飼養(yǎng)環(huán)境：大鼠自由活動、飲水、攝食，12 h晝夜，室溫 21～23 ℃，相對濕度為45%～55%。所有實驗動物程序均獲石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。實驗過程遵循中國國家科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 VTA區(qū)毀損模型建立

在異氟醚麻醉下通過耳桿和齒栓將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，維持大鼠肛溫于37～38 ℃范圍內(nèi)。經(jīng)腦立體定位儀定位VTA坐標(biāo)：距離囟門后1 mm，橫向6.0 mm，深度7.0 mm。在大鼠顱骨表面鉆孔后，利用微量注射針注入1 μL的6-OHDA，注射時間為1 min，注射完畢后停留10 min，以免藥物溢出?；謴?fù)14 d后行尾靜脈置管。

1.3 AAV介導(dǎo)RNAi的構(gòu)建

用AAV載體構(gòu)建包裝了一個Slc6a3敲低的病毒，血清型2型(Genchem，Shanghai)，其靶點序列為：5′-CGCTGAGTACTTCGAAATGTC-3′，元件順序為：U6-MCS-CAG-mCherry。

1.4 VTA區(qū)立體定位注射AAV2·DAT·RNAi及EEG電極植入

在異氟醚麻醉下，經(jīng)腦立體定位儀定位VTA坐標(biāo)(如前所述)，在大鼠顱骨表面鉆孔后，利用微量注射針注入AAV2·DAT·RNAi，注射總量為3 μL，注射時間為10 min，注射完畢后停留10 min，待藥物完全擴散再緩慢移除注射針，其后在其硬腦膜外植入四個不銹鋼螺絲用于監(jiān)測腦電圖(Electroencephalogram EEG)。腦電電極分布位置：兩個額部電極分別位于前囟向前3.9 mm并旁開2.0 mm處；兩個枕部電極位置位于前囟向后7.4 mm并且旁開5 mm。外套管與電極均由牙科膠水固定于顱骨表面后縫皮。術(shù)畢連續(xù)3 d肌肉注射青霉素20U預(yù)防感染。待其從麻醉狀態(tài)下安全蘇醒，放入單獨鼠籠內(nèi)飼養(yǎng)并恢復(fù)21 d并行尾靜脈置管。

1.5 翻正反射

各組大鼠分別經(jīng)尾靜脈以11 mg·kg-1的劑量緩慢推注丙泊酚，觀察其翻正反射消失(LORR)時間及恢復(fù)(RORR)時間。翻正反射消失定義為藥物注射完畢后，將大鼠置于屈膝仰臥位，大鼠在30 s內(nèi)不能從仰臥位變?yōu)楦┡P位。LORR 即為靜脈丙泊酚注射完畢至大鼠翻正反射消失的時間，稱為麻醉誘導(dǎo)時間。翻正反射恢復(fù)定義為大鼠在仰臥位時，5 s內(nèi)能夠恢復(fù)正常的體位,即四腳同時著地，RORR即為丙泊酚注射完畢后待大鼠翻正反射恢復(fù)的時間，稱為麻醉蘇醒時間。超過30 min后翻正反射未恢復(fù)，則排除該只老鼠。

1.6 在體腦電記錄

各組大鼠經(jīng)尾靜脈以11 mg·kg-1的劑量緩慢推注丙泊酚進行誘導(dǎo)，后以70 mg·kg-1·h-1的劑量持續(xù)泵入丙泊酚，維持30 min后停止輸注，記錄大鼠丙泊酚全麻中麻醉期和蘇醒期的腦電活動。

1.7 免疫熒光實驗

P組大鼠經(jīng)尾靜脈以11 mg·kg-1的劑量緩慢推注丙泊酚進行誘導(dǎo)，后以70 mg·kg-1·h-1的劑量持續(xù)泵入丙泊酚，共30 min；S組大鼠經(jīng)尾靜脈以相同速度輸注等劑量生理鹽水，共計30 min；NC組、AAV·NC組和AAV組大鼠經(jīng)尾靜脈以11 mg·kg-1的劑量緩慢推注丙泊酚進行誘導(dǎo)，然后以70 mg·kg-1·h-1的劑量泵入丙泊酚，共計60 min；各組大鼠停藥后10 min用戊巴比妥鈉按60 mg·kg-1腹腔注射深麻醉，用4%多聚甲醛固定液經(jīng)心臟實施灌注取腦，制備石蠟切片。取PFC區(qū)或VTA區(qū)腦片用5%BSA封閉1 h，滴加c-fos(bs-0469R)或DAT(ab-120607)一抗4 ℃孵育12 h，PBS洗滌后，滴加相應(yīng)的熒光二抗，濕盒避光室溫孵育2 h，PBS洗滌后暗室下用0.5 μg·mL-1的DAPI溶液染細胞核15 min，封片后熒光顯微鏡下觀察。每張切片在200×視野下隨機選3個不同視野進行采圖。

1.8 Western blot檢測目標(biāo)蛋白的表達量

各組大鼠停藥后10 min取腦，快速剝離PFC，常規(guī)提蛋白法獲得PFC組織總蛋白樣品。取10 μL樣品常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)模。室溫封閉后按濃度1∶500進行內(nèi)參及目的蛋白一抗孵育過夜，室溫孵育二抗2 h，暗室曝光。應(yīng)用image J圖像分析軟件測定各組目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值之比來分析各組蛋白含量。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 毀損VTA區(qū)后各組大鼠LORR、RORR比較

與對照組(NC)比較，6-OHDA毀損組(6-OHDA)大鼠LORR縮短(P<0.001)，RORR延長(P<0.001)(圖1)。

與NC相比，***P<0.01

2.2 丙泊酚麻醉對VTA區(qū)DAT表達影響

與鹽水組(Saline，S)比較，丙泊酚麻醉組(Propofol,P)大鼠VTA區(qū)DAT表達降低(P<0.05)(圖2)。

與NC相比，**P<0.05

2.3 VTA區(qū)內(nèi)注射AAV2·DAT·RNAi轉(zhuǎn)染驗證

AAV轉(zhuǎn)染21 d后取VTA區(qū)組織切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察到病毒轉(zhuǎn)染細胞出現(xiàn)明顯紅色熒光(mcCherry)，提示轉(zhuǎn)染成功(圖3)。

圖3 VTA區(qū)內(nèi)神經(jīng)元紅色熒光(mCherry)表達

2.4 各組大鼠LORR、RORR結(jié)果比較

與NC組比較，AAV組LORR延長(P<0.005)，RORR縮短(P<0.001)，表明AAV組大鼠丙泊酚麻醉誘導(dǎo)的時間延長，從丙泊酚麻醉中蘇醒的時間縮短。AAV·NC組LORR、RORR差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

與NC組相比，**P<0.005；與NC組相比，***P<0.001

2.5 各組大鼠皮層腦電分析

在丙泊酚麻醉期及蘇醒期記錄各組大鼠腦電，與NC組比較，AAV組在丙泊酚麻醉期α波、β波頻率增多(P<0.05)，θ波頻率減少(P<0.05)；丙泊酚麻醉蘇醒期，與NC組比，AAV組β波頻率增多(P<0.05)，θ波頻率減少(P<0.05)，余各波無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；與NC組比，AAV·NC組各波無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。通過丙泊酚麻醉期間的腦電圖可觀察到，NC組麻醉期腦電圖呈明顯爆發(fā)-抑制狀態(tài)(圖5)，提示大鼠皮層活動處于深抑制狀態(tài)；AAV組在麻醉期爆發(fā)-抑制波減少且頻率快、振幅小，提示麻醉深度淺于NC組(圖6)。

表1 丙泊酚麻醉期及蘇醒期各組大鼠腦電圖各波頻率占比

圖5 丙泊酚麻醉下NC組腦電圖及時頻圖分析

圖6 丙泊酚麻醉下AAV組腦電圖及時頻圖分析

2.6 各組大鼠PFC區(qū)c-fos蛋白表達

2.6.1 免疫熒光

免疫熒光結(jié)果如圖7所示，前額葉皮層綠色熒光標(biāo)記的為c-fos陽性神經(jīng)元，其表達情況可反應(yīng)PFC神經(jīng)元的活性。

與鹽水組(Saline，S)比較，丙泊酚組(Propofol,P)c-fos蛋白表達降低(P<0.05)，表明大鼠在丙泊酚麻醉期間PFC神經(jīng)元活性降低；丙泊酚麻醉蘇醒期間，與NC組比較，AAV組c-fos蛋白表達增高(P<0.05)，表明AAV組大鼠在丙泊酚麻醉蘇醒期PFC神經(jīng)元活性較NC組增強；與NC組比較，AAV·NC組c-fos蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖7)。

與S相比，***P<0.01；與NC組相比，***P<0.01

2.6.2 Western blot

與S組比較，P組c-fos蛋白含量明降低(P<0.01)。與NC組比較，AAV組c-fos蛋白含量增高(P<0.01)；與NC組比較，AAV·NC組c-fos蛋白含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖8)。

與S相比，***P<0.01；與NC組相比，***P<0.01

3 討論

全身麻醉是一種可逆的、藥物誘導(dǎo)的中樞抑制狀態(tài)，包括意識消失、遺忘、鎮(zhèn)痛和無體動。因此，全身麻醉是一種可逆的昏迷，而并非類似于任何階段的睡眠[5-6]。丙泊酚憑借其起效快、無蓄積等優(yōu)勢已成為全球最常用的靜脈麻醉藥，其主要通過GABAA受體發(fā)揮作用，通過肝腎進行代謝，在臨床中，有7%左右的患者可發(fā)生丙泊酚麻醉蘇醒延遲，尤以老年人或肝腎功能不全的患者為著，且目前暫無有效的促蘇醒藥物。

中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)位于中腦邊緣，具有密集的多巴胺能神經(jīng)元，已被證實參與了多方面的調(diào)節(jié)：如獎賞及成癮行為、睡眠與覺醒、情緒等[2]，但其在調(diào)節(jié)丙泊酚全身麻醉-覺醒中的作用機制尚不明確。多巴胺是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，多巴胺分泌及代謝異常可造成一系列病理性改變[7-8]，臨床上常用安非他命等藥物增加胞外多巴胺的釋放用來治療注意力缺陷多動癥，這些藥物也被證實與覺醒相關(guān)，被用來治療睡眠障礙方面的疾病[9-12]，但其是否可調(diào)節(jié)全身麻醉的覺醒還尚不明確。VTA區(qū)中除了含有大量多巴胺神經(jīng)元外還含有一部分GABA能神經(jīng)元及谷氨酸能神經(jīng)元，有研究顯示，VTA中的多巴胺能神經(jīng)元及GABA能神經(jīng)元處于相互平衡的狀態(tài)，清醒狀態(tài)下，VTA中多巴胺能神經(jīng)通路發(fā)揮主導(dǎo)作用并且抑制GABA能神經(jīng)通路，使機體處于覺醒狀態(tài)[13]。故VTA內(nèi)多巴胺能通路在丙泊酚全身麻醉及蘇醒的作用可能是通過腦內(nèi)多種機制共同調(diào)節(jié)的。

在本研究中，通過6-OHDA毀損VTA后發(fā)現(xiàn)大鼠翻正反射消失時間縮短，翻正反射恢復(fù)時間延長，表明VTA參與丙泊酚全身麻醉的誘導(dǎo)與蘇醒，由此進一步驗證DAT在丙泊酚麻醉過程中含量的動態(tài)變化，從而證明DAT參與丙泊酚全身麻醉過程。其后本研究通過腺病毒轉(zhuǎn)染，使DAT表達下降，得出AAV組的大鼠翻正反射消失時間延長，翻正反射恢復(fù)時間減少，提示DAT在丙泊酚麻醉致意識消失及恢復(fù)的過程中都發(fā)揮了作用。有研究表明，丙泊酚可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生慢振蕩損害皮層內(nèi)通路，并通過皮層、丘腦及其他覺醒相關(guān)核團共同產(chǎn)生作用，丙泊酚麻醉時的腦電變化表現(xiàn)為隨著麻醉的加深出現(xiàn)紊亂的高頻活動，當(dāng)進入深麻醉狀態(tài)時，出現(xiàn)δ波增多及爆發(fā)-抑制樣波形，且麻醉越深，抑制時間越長[14-15]。在本實驗中，當(dāng)VTA區(qū)DAT敲低后，腦電中低頻δ波減少，高頻α波及β波增多，爆發(fā)抑制率降低，腦電轉(zhuǎn)為類覺醒波，該結(jié)果與行為學(xué)結(jié)果相一致。c-fos是反應(yīng)神經(jīng)元活性的經(jīng)典指標(biāo)，大量研究表明，在睡眠狀態(tài)下c-fos可降低其表達。在本研究中，丙泊酚麻醉組大鼠額葉皮層的c-fos與輸注生理鹽水組大鼠相比顯著降低，提示丙泊酚麻醉期間額葉皮層神經(jīng)元活性降低，而AAV組大鼠在丙泊酚麻醉蘇醒期間額葉皮層的c-fos表達較NC組增多，表明DAT敲低后可進一步興奮大腦皮層，從而促進丙泊酚麻醉覺醒。

綜上，本研究證實了VTA區(qū)DAT參與了大鼠丙泊酚全麻的蘇醒，可能機制是VTA區(qū)DAT通過調(diào)節(jié)胞外多巴胺濃度，進而興奮PFC神經(jīng)元，最終促使大鼠從丙泊酚麻醉中蘇醒。