周 潔，劉志光，譚建龍，侯旭陽，賀 君，吳趨薈

（1.湖南師范大學附屬第一醫(yī)院，長沙 410000；2.中南大學湘雅二醫(yī)院，長沙 410000；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410000）

肺癌是全球最常見的癌癥，在2018 年新診斷癌癥病例中占比11.6%，在因癌癥死亡的病例中占比18.4%［1］。在我國，肺癌也是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率、致死率均居首位，5 年生存率僅為19.7%［2］。非小細胞癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的肺癌病例類型，約占肺癌總病例的85%［3］，多數(shù)NSCLC 診斷時已處晚期［4］。由于診斷時多處于晚期、對化療藥物易耐受、快速轉(zhuǎn)移和易復發(fā)等特性導致治療方案選擇有限和患者生存期較短［5，6］。百合固金湯（BHGJT）出自《慎齋遺書》，全方由百合、生地、熟地、當歸、玄參、白芍、桔梗、麥冬、貝母、甘草組成。BHGJT善補氣陰而平虛火，治肺腎陰虛，可使肺金寧、肺氣順，契合了中醫(yī)治療肺癌“攻邪不傷正”、“治病求本”的治療大法。但其治療NSCLC 的現(xiàn)有現(xiàn)代分子理論基礎薄弱，因而深入探討B(tài)HGJT 在NSCLC 中的殺傷機制具有重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 動物 雄性無胸腺裸鼠20 只，6 周齡，SPF 級，小鼠體重約為18g，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，保持室溫25℃和空相對濕度恒定60%，12h 明暗循環(huán)，每天以標準飼料飼養(yǎng)。本實驗通過中南大學湘雅二醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.2 細胞 選用NSCLC 細胞株A549 和H1299，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。A549 細胞在添加1%青霉素鏈霉素和10%胎牛血清的F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，H1299 細胞在添加1%青霉素鏈霉素和10%胎牛血清的RPMIR-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細胞置于37℃下5%二氧化碳的加濕培養(yǎng)基中。

1.3 藥物 BHGJT 方劑由10 種臨床中經(jīng)常使用的中草藥組成（生地、熟地、當歸各9 克，白芍、甘草各3 克，麥冬、貝母、百合各1.5 克，玄參、桔梗各2.4 克）。根據(jù)中國古籍《慎齋遺書》確定了本研究的劑量。制備BHGJT 的原料藥來自湖南省中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。將BHGJT 生藥置于70%乙醇浸泡30 分鐘，采用回流法提取成分，過濾兩次。將過濾液體通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，干燥成粉末。將BHGJT 粉末用0.9%的生理鹽水稀釋至0.5g/mL。制備小份BHGJT 溶液，并在-20℃下儲存，直至使用。

1.4 試劑 4%多聚甲醛（新賽美生物科技有限公司）；CCK-8 試劑盒，牛血清白蛋白，RIPA 緩沖液，流式周期試劑盒、結(jié)晶紫染色液（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司）；DAB 染色液，蘇木素精（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；EdU 檢測試劑盒，流式凋亡試劑盒（上杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；Bax 抗體，Bad 抗體，Ki67抗體，Bcl-2 抗體，GAPDH 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；Cleaved caspase9 抗體（安諾倫（北京）生物科技有限公司）；Cleaved caspase3 抗體（美國CST 公司）

1.5 儀器 微板分光光度計（美國Thermo Fisher 公司）；增強化學發(fā)光系統(tǒng)（美國Life Tec 公司）；熒光顯微鏡觀察細胞（美國Olympus Inc 公司）；BD FACSARIA II流式細胞儀（美國Becton Dickinson 公司）；Prism 軟件（GraphPad Prism 6）；ImageJ 軟件（版本11）。

1.6 方法

1.6.1 細胞活性/增殖實驗 用CCK-8 試劑盒檢測細胞活性/增殖率。將細胞置于96 孔板中，每組至少3個重復，分別加入不同劑量的BHGJT，在37℃下培養(yǎng)24h。將CCK-8 試劑添加到每個孔中并培養(yǎng)3 小時，然后使用微板分光光度計測定上樣孔在450 nm 處的OD值。所有數(shù)值均與未添加細胞的對照組標準化，并以平均值±標準差表示。

1.6.2 克隆形成實驗 通過稀釋梯度稀釋NSCLC 細胞，然后在6 孔板中每孔接種5x103個NSCLC 細胞，按0.5mg/mL 加入BHGJT。細胞培養(yǎng)7d，PBS 洗滌2 次，4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色液染色。

1.6.3 皮下移植瘤模型 將3x106個A549 細胞注射到裸鼠右背側(cè)（n=5）。設置對照組和處理組，處理組中的裸鼠每天按500mg/kg 灌胃BHGJT。

1.6.4 蛋白質(zhì)印跡實驗 將處理過的NSCLC 細胞在添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液中裂解，并在冰上孵育30 分鐘。丟棄沉淀后收集上清液。在變性的蛋白質(zhì)中加入上樣緩沖液，然后加到SDS-PAGE的腔室中，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF 上。用5%BSA 封閉1h后，用稀釋后的一級抗體在4℃孵育過夜。第二天，用TBST 漂洗PVDF 膜3 次，每次10min，然后用1：2000稀釋的二抗體在室溫下孵育1h。免疫復合物通過增強化學發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。使用ImageJ 軟件對條帶進行分析和量化。

1.6.5 免疫組化染色 從石蠟包埋樣品中制備4μM 厚的切片，然后依次去石蠟化，然后在黑暗中用3%H2O2孵育15 分鐘，用枸櫞酸鈉緩沖液（10 mM 檸檬酸鈉和0.05%Tween 20，pH 6.0）在96°C 下進行酶原修復，PBS洗滌3 次后，用ki67 和caspase-3 抗體孵育2h，以兔對照IgG 為對照，而后二抗孵育。進行DAB 染色，后用蘇木精染核。然后將切片置于返藍液中返藍，二甲苯中浸泡脫水處理，并用中性樹脂固定。

1.6.6 Ed U 實驗 細胞接種于24 孔板中培養(yǎng)24h，第二天用PBS 沖洗一次，37 ℃下用Ed U 培養(yǎng)2h，再用PBS 沖洗3 次。在用0.25%Triton X-100 滲透后，用DAPI 染核，而后封片。使用熒光倒置顯微鏡觀察細胞。

1.6.7 流式細胞術(shù) 流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡率。取各組細胞，使用DPBS 重懸清洗細胞3 次，而后于1×結(jié)合緩沖液中復懸浮，37℃下用annexinv和PI 溶液染色30min。接下來，這些細胞被送到BD FACSARIA II 流式細胞儀進行檢測。PI 周期檢測試劑盒按照制造商的指南使用。染色后，送到BD FACSARIA II 流式細胞儀進行檢測。

1.6.8 統(tǒng)計分析 所有統(tǒng)計分析均使用Prism 軟件進行。采用雙尾Student t 檢驗評估兩組之間的顯著差異。對于三組甚至更多的組別，采用單因素方差分析。P 值的閾值為0.05，當P 值小于0.05，則認為組間具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BHGJT 體外抑制NSCLC 的增殖和克隆形成 為了驗證BHGJT 在體外對NSCLC 的抑制作用，我們進行了CCK-8、EdU 和克隆形成實驗。在給藥組中，隨著BHGJT 的給藥濃度增加，NSCLC 細胞的活性逐漸降低（圖1A）。此外，EdU 分析證實，在0.5mg/mL BHGJT 處理后，NSCLC 細胞A549 和H1299 的增殖活性明顯減弱（圖1B 和C）（P＜0.01）。接下來，我們進行了克隆形成實驗。NSCLC 細胞A549 和H1299 在BHGJT 治療后，克隆形成的能力明顯降低（圖1D）（P＜0.01）。因此，這些數(shù)據(jù)表明BHGJT 能在體外顯著抑制NSCLC 的活性和克隆形成，抑制NSCLC 細胞的增殖。

圖1 A：用CCK-8法檢測A549和H1299的細胞活性；B和C：EdU實驗檢測A549和H1299的細胞增殖能力；D：用克隆形成實驗測定細胞克隆能力。*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 BHGJT 體內(nèi)殺傷NSCLC 為了在體內(nèi)進一步驗證BHGJT 對NSCLC 的作用，我們將A549 細胞用基質(zhì)膠重懸后，皮下注射到裸鼠背部皮下。每日給實驗組裸鼠按500mg/kg BHGJT 灌胃，對照組以生理鹽水灌胃。與對照組相比，實驗組的腫瘤體積明顯減小（圖2A 和B）（P＜0.05）。四周后，我們將裸鼠的皮下移植瘤取下，進行石蠟包埋切片，然后做免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)實驗組中腫瘤組織的Ki67 表達明顯降低，而Cleaved caspase 3的表達顯著增高。Ki67 是一種常用來標記細胞增殖能力的指標，而caspase 3 是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，剪切體caspase 3 高表達提示BHGJT 在體內(nèi)誘發(fā)顯著的凋亡。這些結(jié)果說明，BHGJT 在體內(nèi)是通過誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡來抑制NSCLC 細胞的生長，從而發(fā)揮治療NSCLC 的作用。

2.3 BHGJT 通過誘導NSCLC 細胞周期G0G1 阻滯和凋亡治療NSCLC 我們的結(jié)果初步證實BHGJT 對NSCLC 具有確切的殺傷效果，但其殺傷腫瘤細胞的生物學機制尚不清楚。我們先用PI 染色細胞，然后用流式細胞儀分析BHGJT 治療前后的細胞周期分布。在兩種細胞系的治療組中觀察到G0G1 期所占比例明顯增加（圖3A 和B）。在A549 細胞中，對照組和治療組的G0G1 期分別為55.3%和64.7%；在H1299 細胞中，對照組和治療組的G0G1 期分別為52.5%和70.1%。因此，BHGJT 處理后NSCLC 細胞發(fā)生了明顯的G0G1 期阻滯，進而抑制了細胞增殖。進一步，我們通過流式細胞術(shù)測定細胞凋亡比例，發(fā)現(xiàn)處理組腫瘤細胞發(fā)生了明顯的凋亡（圖3C）。在A549 細胞中，對照組和治療組（2.0mg/ml BHGJT）的凋亡比例分別為3.19%和54.2%；在H1299 細胞中，對照組和治療組（2.0mg/ml BHGJT）的凋亡比例分別為3.63%和44.65%。在不同濃度的BHGJT 作用下，促凋亡相關(guān)蛋白Bad、Bax、Cleaved caspase 9 和Cleaved caspase 3 呈濃度依賴性表達增高，而抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 呈濃度依賴性表達降低（圖3D）。因此，這些數(shù)據(jù)表明BHGJT 是通過誘導NSCLC細胞的G0G1 周期阻滯和凋亡來發(fā)揮治療NSCLC 的作用。

圖二 A：將A549細胞皮下注射于裸鼠體內(nèi)；B：移植瘤的體積；C和D：Ki67和剪切體caspase-3的IHC染色。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

圖三 A和B：流式細胞儀檢測A549和H1299細胞周期的變化；C：流式細胞儀檢測A549和H1299細胞凋亡率的變化；D：通過蛋白印跡實驗檢測A549和H1299細胞中Bad、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase 9、Cleaved caspase 3的蛋白表達變化。

3 討論

目前，中醫(yī)藥在治療包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的前景已引起全球的關(guān)注。許多中草藥的生物活性成分顯示出強大的抗癌能力且毒副作用也較?。?，8］。BHGJT 是目前治療肺癌較為常用且療效顯著的方劑之一［9，10］。臨床上年邁體虛及中晚期NSCLC 患者多數(shù)正氣已虛，癌瘤內(nèi)生及放化療藥物長期使用使陰液暗耗，久病及腎，腎水不足則虛火邢金，加之久咳肺陰必傷，進一步耗傷肺陰，故常表現(xiàn)為氣陰兩虛及肺腎兩虛的表現(xiàn)，BHGJT 善補氣陰而平虛火，主治肺腎陰虛，可使肺金寧、肺氣順。我們的研究發(fā)現(xiàn)BHGJT 可顯著降低NSCLC 細胞活性、抑制增殖、干擾體外克隆形成、抑制腫瘤的體內(nèi)生長并誘導顯著凋亡，具有確切的抗癌作用。

現(xiàn)代藥理學研究提示多種BHGJT 成分具有確切的抗癌作用。如在黑色素瘤和Lewis 肺癌裸鼠移植瘤中百合純多糖有較強的治療作用［11］。熟地黃水體液裸鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)其分泌的細胞因子TNF-α明顯增加，表明熟地黃水具有一定的抗腫瘤作用［12］。當歸中的當歸多糖可抑制肺癌細胞共培養(yǎng)微環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細胞的異常增殖及降低腫瘤相關(guān)成纖維細胞相關(guān)分子的表達［13］。這些證據(jù)表明BHGJT 中有多種成分具有抗腫瘤作用，這與我們的研究結(jié)論是相符的。在此基礎上，探索BHGJT 中起主要的成分，尋找靶向清晰的抗瘤成分將對臨床上治療肺癌起著至關(guān)重要的作用。

中藥治療腫瘤的機制大多集中在抑制細胞增殖、誘導凋亡和自噬。比如，澤漆湯通過p53 途徑誘導NSCLC 細胞凋亡和G0G1 期阻滯［14］；雙氫青蒿素可以上調(diào)死亡受體5 的表達并與TRAIL 協(xié)同誘導人前列腺癌細胞發(fā)生凋亡［15］；華蟾毒精可能通過DR 介導的外源性通路，引起肝癌細胞發(fā)生凋亡［16］。自噬性死亡也是中藥殺傷腫瘤的重要方式。傳統(tǒng)中藥如雷公藤、穿心蓮富含的山奈酚可活化IRE1-JNK-CHOP 信號通路，并抑制G9a 介導的表觀遺傳學改變，誘導自噬性死亡，從而抑制胃癌細胞生長［17］。通過流式細胞術(shù)分析，在BHGJT 治療后，NSCLC 細胞發(fā)生明顯的凋亡和周期阻滯。腫瘤促凋亡相關(guān)蛋白Bad、Bax、Cleaved caspase 9和Cleaved caspase 3 在治療后表達也明顯增加［18，19］，而抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 則減少［20］，這都提示BHGJT 能有誘導腫瘤發(fā)生凋亡，從而起到抗癌作用。

總之，我們從細胞和動物兩個層面證實了BHGJT能抑制NSCLC 細胞活性和增殖，干擾體外克隆形成并顯著降低腫瘤的體內(nèi)生長。而且我們進一步揭示了BHGJT 通過誘導周期阻滯和凋亡的方式殺傷NSCLC。本研究利用體外和在體實驗證實了BHGJT 對NSCLC的治療作用，驗證了其作用的生物學機制，為研究其更深層次的分子機制打下基礎，為推動BHGJT 這一經(jīng)典方劑治療肺癌提供理論支持。