姚美清，余 夢，吳吉平，黃利華，楊作成

（1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科，長沙 410013；2. 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，長沙 410013）

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種急性、累及全身的系統(tǒng)性血管炎性疾病，主要影響5 歲以下兒童和嬰幼兒，是兒童后天獲得性心臟病的主要原因之一。至今川崎病的發(fā)病機(jī)制和病因尚不明了，認(rèn)為川崎病可能是一種由不明原因感染引起的免疫系統(tǒng)高度活化，及細(xì)胞因子介導(dǎo)損傷性血管炎，使得心臟和冠狀動脈受累，甚至可發(fā)展成為缺血性心臟病、心肌梗死［1］。遺傳因素在川崎病的冠狀動脈損傷（CAL）及遺傳易感性中發(fā)揮一定的作用。miRNA 是一類保守的非編碼小分子RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)。每個(gè)miRNA 可調(diào)控多種靶基因，在炎癥、免疫和心血管疾病等方面發(fā)揮著重要作用。既往已經(jīng)有關(guān)于miRNA基因多態(tài)性與川崎病的相關(guān)性進(jìn)行了較多研究，如羅頡等［2］研究了mTOR 基因多態(tài)性與KD 的關(guān)聯(lián)性，但未發(fā)現(xiàn)其rs6540964、rs75398396 位點(diǎn)多態(tài)性與KD 相關(guān)。Zha 等［3］發(fā)現(xiàn)，miR-146a 多態(tài)性與KD 并發(fā)CAL 相關(guān)，其rs2910164 位點(diǎn)G/C 的GG 基因型和rs57095329 A/G位點(diǎn)的A 等位基因可能是KD 并發(fā)CAL 的危險(xiǎn)因素。報(bào)道顯示，miR-181a 與自身免疫、炎癥反應(yīng)、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］，但有關(guān)miR-181a 基因多態(tài)性與川崎病的關(guān)聯(lián)性尚未見報(bào)道。本研究通過病例對照的方法，探究miR-181a 基因rs77418916 位點(diǎn)多態(tài)性與KD 發(fā)病及其合并CAL 的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 對象 KD 組：隨機(jī)選取2016 年～2019 年間在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院治療的100 例中國漢族KD 患兒，全部患兒均符合KD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。所有患兒入院前均未使用丙種球蛋白（IVIG）和阿司匹林治療。其中KD 合并CAL 的診斷指標(biāo)為：＜3 歲患兒，冠脈內(nèi)徑≥2.5mm；＜5 歲患兒，冠脈內(nèi)徑≥3mm；≥5 歲者，冠脈內(nèi)徑≥4mm；存在某些節(jié)段冠脈內(nèi)徑為相鄰段的1.5 倍以上；管壁不規(guī)則；冠狀動脈內(nèi)徑/主動脈根部內(nèi)徑比值＞ 0.3［6］。本組資料中，川崎病合并冠狀動脈損傷組（KDCAL）組25 例，其中男18 例，女7 例，平均年齡3.85±3歲；無冠狀動脈損傷組（KD-NCAL）組75 例，其中男40例，女35 例，平均年齡4.19±1.92 歲。KD-CAL 組與KD-NCAL 組性別分布之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

對照組：選擇100 例在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院做健康體檢的中國漢族兒童，入選兒童既往無KD 病史，并排除風(fēng)濕性疾病、心血管疾病、感染性疾病、腫瘤等。其中男性58 例，女性42 例，男女比例為1.38：1，年齡為1.68±2.05 歲。KD 組與對照組性別分布之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

在征得患兒父母或監(jiān)護(hù)人的同意后，用一次性采血管（含抗凝劑EDTA-K2）采取KD 組與對照組患兒2ml靜脈血，血液標(biāo)本用冷凍保存管裝取，置于-80℃冰箱內(nèi)貯存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采用一次性采血管（含抗凝劑EDTA-K2）采取2 mL 靜脈血，用Promega DNA 提取試劑盒，按說明書要求提取各組外周血DNA，用NanoDrop ND-2000C 分光光度計(jì)（Thermo，USA）進(jìn)行純度和濃度的測定，放入-80℃冰箱內(nèi)貯存。

1.2.2 多態(tài)性檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)-直接測序法（PCR-SBT）技術(shù)檢測miR-181a 基因多態(tài)性，通過GeneBank 檢索到miR-181a 基因堿基序列，設(shè)計(jì)引物，上游引物為：5'-GTGGGTTGTTGAGAATTTAATGAG-3'，下游引物為：5'-CAGCGTTGAATGTTCCTTGG-3'，引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。采用PCR 反應(yīng)體系為25μL，包括制好的模板DNA 1μL，引物各1μL，2×Master Mix 10μL，去離子水加至25μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：在98℃下對樣品進(jìn)行3min 的預(yù)變性一次；隨后加入Taq DNA 聚合酶進(jìn)行如下的35 次循環(huán)：98℃（10s）→54℃（30s）→72℃（10s）；72℃終末延伸2min，4℃保存。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下照相觀察結(jié)果并記錄電泳圖譜，初步判定擴(kuò)展成功與否。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物外送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行基因測序。測序結(jié)果用Chromas 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 表示，基因型和等位基因頻率采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗(yàn)2 組基因型頻率及等位基因頻率是否符合遺傳平衡。

2 結(jié)果

2.1 miR-181a 基因位點(diǎn)多態(tài)性檢測 miR-181a 基因rs77418916 位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增片段大小為409 bp，使用1%瓊脂糖凝膠電泳分離（圖1）。將PCR 所得產(chǎn)物進(jìn)行基因測序，顯示rs77418916 位點(diǎn)存在AA、AT、TT 等3 種基因型（圖2）。KD 組、健康對照組miR-181a 基因rs77418916 位點(diǎn)基因型頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），說明本研究的受試對象組間基因型頻率符合遺傳平衡定律，所選對象具有群體代表性。

圖1 miR-181a基因rs77418916位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 miR-181a基因rs77418916位點(diǎn)測序圖 A：AA基因型；B：AT基因型；C：TT基因型

2.2 KD 患兒miR-181a 基因rs77418916 位點(diǎn)多態(tài)性的變化 在KD 組與健康對照組之間AA、AT、TT 基因型頻率和 A、T 等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。miR-181a 基因rs77418916 位點(diǎn)多態(tài)性在KD-CAL 組與KD-NCAL 組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 對照組與KD組miR-181a基因rs77418916位點(diǎn)多態(tài)性分布

3 討論

川崎病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1、IL-4 和IL-10 等炎性細(xì)胞因子在川崎病急性期升高，認(rèn)為免疫系統(tǒng)的過度激活和細(xì)胞因子活化致血管炎與川崎病的發(fā)病相關(guān)［7］。相關(guān)研究顯示，急性期KD 患兒的CD14+單核/巨噬細(xì)胞中NF-κB 活性明顯增強(qiáng)［8］，NF-κB 在啟動和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)上游環(huán)節(jié)、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子產(chǎn)生及導(dǎo)致炎性損傷方面可能發(fā)揮重要作用［9］。

人類miR-181 家族包含4 個(gè)高度保守的的成員，它們分別是miR-181a、miR-181b、miR-181c 和miR-181d。其中miR-181a 基因定位于人1 號染色體，是一個(gè)多功能miRNA，針對不同的靶點(diǎn)在炎癥反應(yīng)、免疫分化、心血管中起重要作用，并可能通過相關(guān)通路參與影響川崎病的發(fā)生發(fā)展［10］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a 能夠調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6 和IL-8 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［11］。Xie 等［12］發(fā)現(xiàn)，在炎癥刺激狀態(tài)下miR-181a 在巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，IL-1α表達(dá)上調(diào)，同時(shí)證實(shí)了miR-181a 的靶基因是IL-1α，miR-181a 的過表達(dá)顯著降低了炎性細(xì)胞因子（如IL-1β，IL-6 和TNF-α）的產(chǎn)生，同時(shí)miR-181a 可通過靶向TLR4 表達(dá)來抑制NF-κB 活化和活性氧（ROS）的積累，證實(shí)了miR-181a 的抗炎作用［11］。

KD 可導(dǎo)致冠狀動脈損傷，甚至心肌梗死，已成為兒童獲得性心臟病的常見原因。研究發(fā)現(xiàn)miR-181a的過表達(dá)減少了氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）介導(dǎo)的CD83 和CD40 的增加，減少IL-6 和TNF-α的分泌，并增加IL-10 的表達(dá)。這些作用由靶向c-Fos 的3'-UTR的miR-181a 介導(dǎo)，miR-181a 以負(fù)反饋的方式抑制了ox-LDL 誘導(dǎo)的炎癥［13］。Du 等［14］發(fā)現(xiàn)miR-181a 可通過靶向人類巨噬細(xì)胞中的TLR4 抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的血管炎癥。Habib 等［15］發(fā)現(xiàn)TLR4 依賴的巨噬細(xì)胞信號傳導(dǎo)與冠狀動脈疾病有關(guān)。由于miR-181a 基因位點(diǎn)的多態(tài)性可影響相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致其信號通路的異?；罨M(jìn)而引起機(jī)體免疫反應(yīng)的過度激活，從而引起急性全身性血管炎。本研究顯示，miR-181a 基因rs77418916 位點(diǎn)在KD 組與健康對照組之間AA、AT、TT 基因型頻率和 A、T 等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明miR-181a 基因rs77418916 位點(diǎn)的多態(tài)性與KD 易感性及CAL 存在關(guān)聯(lián)的可能性小?？赡転楸狙芯恐袠颖玖科?，或因不同地區(qū)及民族的遺傳差異所致，亦或KD 的發(fā)病并非通過該位點(diǎn)多態(tài)性產(chǎn)生影響等，有待進(jìn)一步研究。