雒麗麗 張昊 楊美欣 王云飛 許景升 徐進(jìn) 姚強 馮潔

（1. 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院 青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測實驗站，西寧 810016；2. 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家植物保護(hù)甘谷觀測實驗站，天水741000）

由鐮孢菌引起的赤霉病是危害麥類作物的一種重要病害，廣泛分布于世界濕潤和半濕潤地區(qū)。小麥赤霉病是我國長江中下游麥區(qū)和東北春麥區(qū)主要流行性病害。近年來，在黃淮冬麥區(qū)也頻繁流行成災(zāi)［1-3］。小麥赤霉病不僅造成產(chǎn)量損失，而且病菌產(chǎn)生的毒素污染小麥籽粒，危害人畜健康［1］。

溫度、降雨和濕度等環(huán)境因素影響小麥赤霉病的發(fā)生流行，且在鐮孢菌和其他真菌的生態(tài)學(xué)中起著重要作用［4-5］。在引起小麥赤霉病的多種鐮孢菌中，禾谷鐮孢菌（Fusarium graminarum）、黃色鐮孢菌（F.culmorum）、燕麥鐮孢菌（F. avenaceum）等為主要致病種［6］，這些菌種分布廣泛，其中禾谷鐮孢菌在世界上較溫暖、潮濕的地區(qū)（如北美和南歐）占主導(dǎo)地位［7］，而黃色鐮孢菌在較寒冷的地區(qū)如歐洲占主導(dǎo)地位［8］。小麥赤霉病原菌的種群組成與地理分布有關(guān)，病原菌因其地理生態(tài)環(huán)境差異在不同國家或不同區(qū)域的主要致病菌種類有所不同［8-9］。近年來，由于全球氣候變暖、稻麥輪作以及免耕技術(shù)的推廣，小麥赤霉病在全世界各產(chǎn)區(qū)呈擴張趨勢［1］。不同區(qū)域病原菌組成也因氣候變暖，品種更替及免耕技術(shù)而有所變化。

不同地理來源赤霉菌的致病力存在一定的差異。據(jù)報道，源自全國不同地區(qū)的禾谷鐮孢菌菌株間均存在顯著的致病力分化，且同一采樣點采集的菌株間也存在明顯的致病力分化［10］。Bai等［11］測定中國和美國的菌株在小麥上的致病力，來自中國的菌株的致病力明顯強于美國菌株。研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢菌的致病力差異與菌絲生長快慢有顯著相關(guān)性［12］，且禾谷鐮孢菌的遺傳分化及產(chǎn)毒類型對其致病力有一定的影響，Carter等［13］采用RAPD分析發(fā)現(xiàn)C組菌株對小麥和玉米的致病力顯著強于A組和B組菌株，且A組產(chǎn)NIV毒素的菌株對玉米的致病力最強。因此明確不同地理來源赤霉菌群體的致病力分化對于病害的區(qū)域性防治策略的制定具有重要意義。

病原物對環(huán)境的適應(yīng)性進(jìn)化是其發(fā)生表型分化（包括致病力分化）的重要原因，其中溫度的適應(yīng)性是一個重要因素。據(jù)報道，導(dǎo)致我國松材線蟲由低緯度向高緯度迅速擴張的原因除人為物流造成的長距離運輸外，松材線蟲本身對溫度的適應(yīng)性進(jìn)化也是重要因素，其南北方種群已經(jīng)形成了差異進(jìn)化，北方種群耐寒性更強［14］。盛若成等［15］報道了低溫條件下北方蟲株 FCBX 對黑松的致病力強于南方蟲株 AMA3。松材線蟲種群在北移過程中經(jīng)過了低溫馴化，在低溫條件下具有更強的繁殖能力［16］。Ellison等［17］利用“反向生態(tài)學(xué)”策略，對來自熱帶加勒比海和亞熱帶路易斯安那地區(qū)的粗糙鏈孢霉菌（Neurospora crassa）群體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，根據(jù)單核苷酸多態(tài)性位點系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)兩地區(qū)的種群發(fā)生了明顯的區(qū)域性分化。在全基因組范圍內(nèi)鑒定到兩個群體“分歧島”，其主要包含有溫度和日照節(jié)律適應(yīng)性基因，推測溫度適應(yīng)性是種群分化的重要因素。溫度適合度實驗證實，路易斯安那亞種群有更強的低溫（10℃）適應(yīng)性。

雖然在世界范圍內(nèi)對病原物溫度適應(yīng)性相關(guān)的致病力分化已有相關(guān)報道，但在鐮孢菌該方面的研究信息較少，不同地理來源的鐮孢菌群體的致病力與當(dāng)?shù)販囟燃斑m應(yīng)性的關(guān)系尚不明確。鑒于此，本研究對采集自緯度差異較大的黃淮冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)的小麥赤霉病病穗上的鐮孢菌進(jìn)行分離鑒定，明確病原菌的種群分布，研究不同溫度條件下不同地理來源群體的致病力差異，為小麥赤霉病區(qū)域性防控策略的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年和2019年間從黃淮冬麥區(qū)（河北省和河南?。┖蜄|北春麥區(qū)（內(nèi)蒙古呼倫貝爾市）24個采樣點采集小麥赤霉病穗。采用組織分離培養(yǎng)和單孢分離法［18］獲得鐮孢菌110株。所有菌株采用15% 甘油保存于-80℃ 超低溫冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 供試菌株活化后，接種到Y(jié)G培養(yǎng)基平板上（YG培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，酵母粉5 g，蒸餾水1 000 mL，121℃ 高壓滅菌 20 min），28℃ 黑暗培養(yǎng)5 d，收集菌絲于2 mL裂解管中，冷凍干燥后，低溫研磨成粉末?；蚪MDNA的提取采用天漠生物公司的真菌/細(xì)菌RNA提取試劑盒。

1.2.2 鐮孢菌種的鑒定 采用EF-1α基因序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行種的鑒定，擴增使用ef1和ef2引物［19］。PCR 反應(yīng)條件 ：95℃ 預(yù)變性 5 min ；95℃變性 30 s，53℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 45 s，30 個循環(huán)；72℃ 延伸 10 min，10℃ 保存。PCR 反應(yīng)體系 25 μL，其中 2× Taq PCR Mix 12.5 μL，12.5 nmoL ef1，12.5 nmoL ef2，DNA 模板62.5 ng，滅菌水10.5 μL。PCR擴增產(chǎn)物由生工生物工程上海有限公司進(jìn)行單向測序，在Fusarium ID 數(shù)據(jù)庫（http：//isolate.fusariumdb.org/index.php）比對測序結(jié)果，一致性大于98%的確定是同一種。

優(yōu)勢單倍型檢測：將優(yōu)勢群體F. graminearum菌 株 的 EF-1α序 列 利 用 MAFFT軟 件［20］進(jìn) 行序列比對，而后利用編寫的Python腳本提取F.graminearum的單倍型，獲得單倍型的種類及個數(shù)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析：從GenBank下載標(biāo)準(zhǔn)菌株參考序列，用MAFFT軟件將本研究所有EF-1α單倍型序列與參考序列進(jìn)行比對，而后采用ModelFinder計算最佳核苷酸替代模型（TIM2e+G4），iqtree軟件最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，100次bootstrap［21］。系統(tǒng)發(fā)育樹的編輯采用 treeio［22］、ggtree［23］和 Adobe Illustrator2020。

1.2.3 致病力測定 每個生態(tài)區(qū)各隨機選取10株禾谷鐮孢菌作為代表性菌株（共20株），在兩個地點進(jìn)行致病力測定。實驗所用小麥品種為揚麥158。在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊實驗基地以及青海大學(xué)西寧實驗基地分別種植3個小區(qū)（2 m× 4 m）。廊坊為2019年10月播種，西寧為2020年3月播種。在小麥揚花初期進(jìn)行接種實驗，廊坊實驗基地于2020年5月10日接種，西寧實驗基地于2020年7月8日接種，每個菌株每小區(qū)接種5穗。日均溫度由實驗基地氣象站記錄。

分生孢子懸浮液制備：取少量菌絲于YG培養(yǎng)基中28℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d，用6 mm打孔器打取菌餅接種于40% 綠豆湯培養(yǎng)基中［24］，在180 r/min、28℃ 條件下?lián)u培14 d，以血球計數(shù)板檢測分生孢子濃度，8 000 r/min 離心后稀釋或濃縮終濃度至1.0 ×106個/mL，保存于-80℃ 備用。

病原菌接種：采用單小花注射接種法。在小麥揚花期，選取長勢相對一致的麥穗，在麥穗中下部小穗接種 20 μL混合均勻的分生孢子懸浮液，噴水霧后，套透明塑料袋保濕5 d。接種19 d 后調(diào)查病小穗率（病小穗率 = 每穗發(fā)病小穗數(shù)/每穗總小穗數(shù)）。兩個生態(tài)區(qū)各隨機選取10株禾谷鐮孢菌作為代表性菌株，共20株菌，每個菌株在每個地點每小區(qū)接種5穗。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用t檢驗比較接種后21 d 兩個實驗基地日平均溫度差異。采用廣義線性模型比較黃淮和東北麥區(qū)赤霉菌群體致病力差異，數(shù)據(jù)分布型為二項分布。

2 結(jié)果

2.1 鐮孢菌種的鑒定

2018 年和2019年間兩個生態(tài)區(qū)共分離菌株110株，供試小麥赤霉病菌各采樣點經(jīng)緯度信息及分離菌株數(shù)量如表1所示。通過 EF-1α基因單倍型序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，所有菌株屬于5個鐮孢菌復(fù)合種，包括Fusarium graminearum species complex、Fusarium sporotrichioides species complex、Fusarium incarnatum-equiseti species complex、Fusarium tricinctum species complex 和Fusarium fujikuroi species complex（ 圖 1）。2018 年間兩個生態(tài)區(qū)共分離出7個種共54株鐮孢菌，F(xiàn).graminarum為46株（85%），2019年間兩個生態(tài)區(qū)共分離出6個種共56株鐮孢菌，F(xiàn). graminarum為50株（89%），表明F. graminarum是2018年和2019年間兩個生態(tài)區(qū)的優(yōu)勢種。黃淮冬麥區(qū)分離出6個種共61株鐮孢菌，F(xiàn). graminarum為52 株（85%），F(xiàn). asiaticum為4 株（6.7%），F(xiàn)IESC 為 2株（3.3%），F(xiàn).verticillioides為1 株（1.6%），F(xiàn). proliferatum為1株（1.6%），F(xiàn). boothii為1株（1.6%）。東北春麥區(qū)分離出6個種共49株鐮孢菌，F(xiàn). graminarum為44株（90%），F(xiàn). cerealis 為 1 株（2%），F(xiàn). sporotrichioides為 1株（2%），F(xiàn). avenaceum 為 1株（2%），F(xiàn).culmorum為 1株（2%），F(xiàn)IESC為1株（2%）。 表明黃淮冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)小麥赤霉病的優(yōu)勢種均為F. graminarum（表2）。

2.2 致病力的測定

2.2.1 接種后21d的日均溫 接種后21 d，兩地日均溫差為-0.2-9.8℃，僅有一天西寧溫度略高于廊坊0.2℃，日均溫差平均值為4.7℃，t檢驗顯示廊坊的日均溫度顯著高于西寧（P ＜ 0.001）（圖2）。

2.2.2 致病力測定結(jié)果 根據(jù)小麥病小穗率，不同菌株間致病力有明顯的差異。廊坊接種結(jié)果顯示，黃淮冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)禾谷鐮孢菌群體平均病小穗率分別為0.202和0.214（圖3，表3），GLM分析表明兩群體致病力無顯著差異（P = 0.7）（表4），說明在較高日均溫條件下，2個群體具有相似的致病力水平。西寧實驗結(jié)果顯示，黃淮和東北群體平均病小穗率為0.254和0.359（圖3，表3），GLM檢驗表明兩群體的致病力表現(xiàn)出明顯的分化，在環(huán)境溫度較低的條件下，東北麥區(qū)的禾谷鐮孢菌群體的致病力水平顯著高于黃淮麥區(qū)群體（P＜0.001）（表4），表明東北春麥區(qū)禾谷鐮孢菌群體在致病力方面具有明顯的低溫適應(yīng)性。

表1 供試小麥赤霉病菌信息Table 1 Information of WHB pathogens from wheat

圖1 EF-1α 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree by EF-1α gene

3 討論

本研究對2018-2019 年黃淮冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)110株赤霉菌的群體組成進(jìn)行了鑒定，共鑒定到5個復(fù)合種內(nèi)共10個種的鐮孢菌，兩個生態(tài)區(qū)分別分離到6個種，說明這兩個區(qū)域的赤霉菌組成較為復(fù)雜。其中F. graminarum（87%）是黃淮冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)小麥赤霉病的優(yōu)勢種群。這與以前的研究結(jié)果一致［19，25］。F. sporotrichioides引起小麥赤霉病是在我國首次發(fā)現(xiàn)。兩區(qū)域禾谷鐮孢菌的致病力測定結(jié)果顯示，廊坊實驗站兩區(qū)域禾谷鐮孢菌群體致病力水平相似，而在西寧實驗站，兩個群體的致病力表現(xiàn)出明顯分化，東北春麥區(qū)禾谷鐮孢菌群體致病力明顯高于黃淮冬麥區(qū)禾谷鐮孢菌群體。

表2 2018和2019年間黃淮冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)小麥鐮刀菌種的分布數(shù)量Table 2 Number of Fusarium species on wheat from the Huanghuai winter wheat region and the Northeast spring China wheat region in 2018 and 2019

圖2 接種后21 d日均溫Fig. 2 Average daily temperature at 21 d after inoculation

圖3 致病力測定結(jié)果Fig. 3 Pathogenicity test results

表3 黃淮和東北群體在兩地平均病小穗率Table 3 Average incidence of diseased spikelets in Huanghuai and Northeast populations in the two sites

表4 廣義線性模型比較群體間致病力差異Table 4 GLM analysis of pathogenicity between groups

致病力是植物病原菌侵染植物的重要表型，其強弱受到多種因素的影響。與寄主植物互作并發(fā)生協(xié)同進(jìn)化是植物病原菌致病力發(fā)生變化的重要因素之一。如小麥條銹菌能夠與當(dāng)?shù)刂髟钥共⌒←溒贩N迅速發(fā)生協(xié)同進(jìn)化，產(chǎn)生對抗病品種具有強毒性的新的生理小種，造成品種抗病性喪失。但目前尚沒有小麥品種影響赤霉菌致病力方面的報道，中國抗赤霉病小麥品種主要種植在長江中下游麥區(qū)，而北方麥區(qū)主栽小麥均為感病品種［2］，本團(tuán)隊前期研究顯示，長江中下游麥區(qū)和北方麥區(qū)來源的小麥赤霉菌群體致病力沒有顯著差異［26］。本研究中黃淮和東北麥區(qū)雖然主栽品種不同，但均為感赤霉病品種，同時結(jié)合廊坊測定致病力無顯著差異的結(jié)果，說明主栽品種可能并不是導(dǎo)致兩區(qū)域赤霉菌群體在西寧表現(xiàn)出致病力差異的原因。殺菌劑選擇壓力也是影響病原菌致病力的重要因素，病原菌對殺菌劑敏感性的提高往往伴隨著適合度的變化。Zhang等［27］發(fā)現(xiàn)對多菌靈產(chǎn)生抗性的禾谷鐮孢菌群體具更高的適合度，其致病力和產(chǎn)毒能力更強。目前，長江中下游麥區(qū)小麥赤霉菌對多菌靈抗性問題嚴(yán)重，而北部麥區(qū)抗性頻率很低［2］。其他常用殺菌劑如戊唑醇、氰烯菌酯等目前尚未檢測到抗性菌株。同時，黃淮麥區(qū)和東北麥區(qū)赤霉病防治措施一致，均為為揚花期1次用藥，因此殺菌劑壓力可能也并不是造成兩區(qū)域赤霉菌群體在西寧表現(xiàn)出致病力差異的原因。

鐮孢菌對寄主植物的致病力受溫度影響較大，不同鐮孢菌種甚至同一種不同群體侵染寄主所需要的最適溫度有所不同［28］。Maurin 等［29］報道雪霉葉枯菌（Microdochium nivale）侵染小麥需要較低的誘導(dǎo)溫度（10-15℃），而禾谷鐮孢菌和黃色鐮孢菌侵染需要25℃以上的溫度，因此，不同的鐮孢菌種對溫度的需求和適應(yīng)能力存在差異，明確病原菌種的分布對研究病害的發(fā)生規(guī)律、調(diào)節(jié)溫度等生態(tài)措施具有重要的指導(dǎo)意義。本研究中黃淮與東北麥區(qū)緯度相差較大，其環(huán)境溫度具有較大差異，因此兩區(qū)域的赤霉菌群體是否對溫度具有一定的適應(yīng)性是我們關(guān)注的重點問題。在環(huán)境溫度較低的西寧實驗站，東北春麥區(qū)禾谷鐮孢菌群體致病力明顯高于黃淮冬麥區(qū)禾谷鐮孢菌群體，說明其具有明顯的低溫適應(yīng)性。

不同地理來源的菌株往往具有與當(dāng)?shù)丨h(huán)境溫度適應(yīng)的特性，并進(jìn)化出了相應(yīng)的環(huán)境適應(yīng)機制，因此在致病力上表現(xiàn)出不同的差異。Brennan等［30］報道了低溫條件下雪霉葉枯菌對小麥幼苗的致病力較高，菌種和地理來源是影響其致病力的主要因素，雪霉葉枯菌分離株長期生活在冷涼多濕環(huán)境產(chǎn)生趨異適應(yīng)，成為遺傳上有差異的、適應(yīng)冷涼環(huán)境的種群。Brennan等［30］還研究了溫度對歐洲鐮孢菌種的生長速率和致病力的影響，來自英國和愛爾蘭的分離株通常在較低溫度范圍（10-25℃）下生長速率較快，而來自意大利和匈牙利的分離株在較高溫度范圍（20-30℃）下生長速率較快。這可能是由于鐮孢菌分離株適應(yīng)了各個來源國普遍存在的特定生長條件形成了溫度生態(tài)類型。Wang等［31］研究了在不同溫度（10℃、15℃、20℃和25℃）條件下與地下三葉草根腐病相關(guān)的真菌（F. avenaceum，Pythium irregulare，Rhizoctonia solani，F(xiàn). oxysporum 和 Phoma medicaginis）的致病力，結(jié)果顯示10℃條件下致病力最高，表明菌株地理來源也對其致病力有一定的影響，但程度不及菌種。Sabburg等［32］為進(jìn)一步探究升高溫度對鐮孢菌致病力的影響，設(shè)置15/15℃，20/15℃，25/15℃和28/15℃四種晝夜溫度處理，對11種小麥品種人工接種假禾谷鐮孢菌進(jìn)行致病力的測定。結(jié)果表明，小麥的莖基部褐變的程度以及病原菌定植的速度和DON的產(chǎn)生量均在15/15℃時最高，此研究驗證了溫度升高會降低病原體的適應(yīng)性。上述研究均表明環(huán)境溫度適應(yīng)性對病原生物的致病力有重要影響。禾谷鐮孢菌是小麥赤霉病最主要的病原菌之一，廣泛分布于世界各地，已有較多報道顯示禾谷鐮孢菌菌株之間致病力差異明顯，但尚未有致病力與地理來源顯著相關(guān)的報道，這可能是以往研究選取的菌株菌處于相似的生態(tài)環(huán)境下。本研究選取黃淮冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)地理距離南北相距約2 000 km，緯度相差超過15°，其環(huán)境溫度具有顯著差異，有利于本地病原菌發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化。研究發(fā)現(xiàn)兩區(qū)域分離群體在低溫下致病力分化明顯，推測不同地理來源的菌株因遺傳變異和自然選擇的結(jié)果代表不同的基因型，所以即使將它們移植于同一生境，它們?nèi)员３制浞€(wěn)定差異。東北春麥區(qū)禾谷鐮孢菌種群由于對其本地氣候條件有較強的適應(yīng)性，從而在低溫條件下致病力顯著增高，其受特定天氣條件的影響以及不斷適應(yīng)當(dāng)?shù)貤l件的自然選擇作用下可能形成一套獨特的與低溫環(huán)境相適應(yīng)的分子機制。

4 結(jié)論

本研究明確了我國黃淮冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)小麥赤霉菌的種群組成，發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢菌是這兩個生態(tài)區(qū)的優(yōu)勢病原菌群體。同時，還發(fā)現(xiàn)不同溫度條件、不同地理來源的禾谷鐮孢菌群體致病力存在顯著差異，證實了禾谷鐮孢菌的致病力受地理分布、氣候條件的影響，明確了赤霉菌的溫度生態(tài)型。研究結(jié)果對于病害的區(qū)域性綜合防治策略的制定具有重要意義。