高 佳，項(xiàng)斌偉，陳書明*，辛嘉英，張建新，王倩倩，衛(wèi) 陽，陳亞偉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.右玉縣畜牧局，山西右玉 037200；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

醋糟是釀醋產(chǎn)業(yè)的下腳料，僅山西省每年的排放量就超過60 萬t，全國(guó)每年排放量達(dá)200 萬t 以上。醋糟作為非常規(guī)飼料，其粗纖維（CF）含量高，粗蛋白質(zhì)（CP）含量低，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低，適口性差，飼用效果不佳[1]。目前，研究者們多通過微生物發(fā)酵提高醋糟的利用率。張建新等[2]研究表明，利用擔(dān)子菌和酵母菌混合發(fā)酵的醋糟中CP 含量顯著增加，CF 含量顯著降低。Wang 等[3]發(fā)現(xiàn)，在蛋雞日糧中添加無花果曲霉發(fā)酵醋糟產(chǎn)物可改善蛋黃顏色，減少蛋雞排泄物中磷含量。好食脈孢菌（Neurospora sitophila）是經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認(rèn)證的可用于食品加工的安全菌種，對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，繁殖能力強(qiáng)[4-5]。鄧永平等[5]研究發(fā)現(xiàn)，好食脈孢菌發(fā)酵過程可產(chǎn)生木聚糖酶。劉慈等[4]研究表明，醋糟經(jīng)好食脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)生了80.9 mg/kg 類胡蘿卜素，CP 與真蛋白（TP）含量均顯著升高，但升高的蛋白質(zhì)為好食脈孢菌菌體及孢子蛋白質(zhì)，瘤胃有效降解率較低。張林等[1]研究表明，紅酵母（Rhodotorula）發(fā)酵醋糟產(chǎn)生的類胡蘿卜素含量?jī)H為6.60 mg/kg，但醋糟CP 和TP 含量顯著提高，且增加量為易于消化吸收的酵母菌體蛋白質(zhì)?；诖?，本研究首先在醋糟培養(yǎng)基中接種高產(chǎn)類胡蘿卜素的好食脈孢菌，測(cè)定發(fā)酵過程中木聚糖酶和纖維素酶的動(dòng)態(tài)變化及發(fā)酵底物還原糖等營(yíng)養(yǎng)成分的含量變化；并在上述發(fā)酵產(chǎn)物中接種嗜好還原糖的紅酵母，研究上述2 種菌協(xié)同發(fā)酵醋糟營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的變化，為醋糟的無害化處理以及富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的類胡蘿卜素功能飼料的研發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 紅酵母與好食脈孢菌由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室保存，醋糟由山西省太谷縣太平莊醋廠提供。

1.2 好食脈孢菌培養(yǎng)基與種子液制備 好食脈孢菌固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基的配制方法參照文獻(xiàn)[6]。好食脈孢菌種子液的制備：將PDA 固體培養(yǎng)基上的好食脈孢菌接種于液體種子培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，調(diào)整好食脈孢菌細(xì)胞數(shù)為1.4×106個(gè)/mL，即為好食脈孢菌種子液。

1.3 紅酵母培養(yǎng)基與種子液制備 紅酵母斜面培養(yǎng)基及液體種子培養(yǎng)基的配制方法參照文獻(xiàn)[6]。紅酵母種子液的制備：將紅酵母斜面培養(yǎng)基上的紅酵母接種于液體種子培養(yǎng)基，于30℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，調(diào)整紅酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)8.5×106個(gè)/mL，即得紅酵母種子液。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及過程

1.4.1 好食脈孢菌發(fā)酵醋糟 稱取干醋糟混合物12 份，每份100 g，分別放入12 個(gè)燒杯，各加蒸餾水140 mL，高壓滅菌30 min，冷卻至室溫。然后，隨機(jī)取9 個(gè)燒杯做為試驗(yàn)組，分別接入好食脈孢菌種子液8 mL，在30℃培養(yǎng)箱發(fā)酵96 h，測(cè)定發(fā)酵過程中木聚糖酶和纖維素酶的動(dòng)態(tài)變化及該發(fā)酵所致發(fā)酵底物中干物質(zhì)（DM）、CF、酸性洗滌纖維（ADF）、中性洗滌纖維（NDF）、半纖維素、粗灰分（Ash）、CP、TP、粗脂肪（EE）、還原糖、總糖及類胡蘿卜素含量的變化。另外3 個(gè)燒杯做為對(duì)照組，分別接入經(jīng)過高壓滅菌的好食脈孢菌種子液8 mL，其他處理與試驗(yàn)組相同。

1.4.2 好食脈孢菌和紅酵母協(xié)同發(fā)酵醋糟 隨機(jī)取6 份醋糟好食脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)物，并隨機(jī)分為2 組，分別為對(duì)照組與試驗(yàn)組。試驗(yàn)組分別接入紅酵母種子液8 mL，30℃發(fā)酵96 h，然后分別測(cè)定該發(fā)酵所致發(fā)酵底物中DM、CF、ADF、NDF、半纖維素、Ash、CP、TP、EE、還原糖、總糖及類胡蘿卜素含量的變化。對(duì)照組分別接入高壓滅活的紅酵母種子液8 mL，其他處理與試驗(yàn)組相同。

1.4.3 纖維素酶及木聚糖酶活性的測(cè)定 采用DNS 法測(cè)定纖維素酶及木聚糖酶的酶活[7]。

1.4.4 營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定 所有樣品均65℃烘干至恒重，回潮48 h，再進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定。DM 測(cè)定參照張麗英[7]的方法，CF、ADF、NDF 采用濾袋法測(cè)定[7]，半纖維素=NDF－ADF，采用《食品中灰分的測(cè)定》（GB 5009.4-2010）測(cè)定樣品中的Ash 含量，采用《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》（GB/T 6432-94）測(cè)定樣品中CP 和TP 含量，采用《飼料中粗脂肪的測(cè)定》（GB/T 6433-2006）測(cè)定樣品中EE 含量，采用DNS 法測(cè)定樣品還原糖及總糖含量[8]，利用王蓉等[9]方法測(cè)定樣品中類胡蘿卜素含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 25.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、Duncan's 多重比較和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋糟發(fā)酵過程觀察 由圖1 可知，好食脈孢菌發(fā)酵24 h，醋糟培養(yǎng)基中尤其是培養(yǎng)基表面會(huì)出現(xiàn)大量灰白色菌絲；發(fā)酵48 h，培養(yǎng)基中菌絲增多，且培養(yǎng)基表面出現(xiàn)少許黃色好食脈孢菌孢子；發(fā)酵72 h，培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量黃色好食脈孢菌孢子，且表面分布較多；發(fā)酵96 h，黃色孢子層加厚，顏色加深。

圖1 好食脈孢菌發(fā)酵醋糟的變化

由圖2 可見，在醋糟好食脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)物中接入紅酵母種子液，發(fā)酵24 h，可見培養(yǎng)基表面出現(xiàn)少量淺粉色菌苔；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基表面出現(xiàn)紅酵母菌苔顏色逐漸加深，發(fā)酵96 h 時(shí)菌苔呈現(xiàn)橙色，表明紅酵母在醋糟培養(yǎng)基中發(fā)酵。

圖2 紅酵母與好食脈孢菌協(xié)同發(fā)酵醋糟結(jié)果

2.2 好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶活性動(dòng)態(tài)變化 由表1 可知，好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)纖維素酶及木聚糖酶活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)；其中發(fā)酵72 h 時(shí)，產(chǎn)纖維素酶活性達(dá)到最大值，為17.2 U/g；發(fā)酵48 h 時(shí)，產(chǎn)木聚糖酶活性達(dá)到最大值，為106.3 U/g。

表1 好食脈孢菌發(fā)酵醋糟產(chǎn)纖維素酶及木聚糖酶活性動(dòng)態(tài)變化 U/g

2.3 醋糟發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分含量變化 由表2 可知，好食脈孢菌發(fā)酵及好食脈孢菌和紅酵母協(xié)同發(fā)酵使發(fā)酵底物重量均極顯著降低（P<0.01）。由表3 可知，與對(duì)照組相比，好食脈孢菌發(fā)酵醋糟CP 含量、TP 含量、還原糖含量分別提高了23.08%、26.43%、88.24%（P<0.01）；EE 含量、總糖含量分別降低了55.41%、29.66%（P<0.01）；尤其是類胡蘿卜素含量較對(duì)照組提高了27.6 倍。與對(duì)照組相比，好食脈孢菌與紅酵母協(xié)同發(fā)酵使醋糟CP 含量、TP 含量、類胡蘿卜素含量分別提高了9.68%、11.70%、12.83%（P<0.01）；EE 含量、還原糖含量、總糖含量分別降低了13.33%、52.94%、20.21%（P<0.01）；Ash 含量升高了5.41%（P<0.05）。

3 討 論

宋增廷[10]對(duì)山西省4 個(gè)地區(qū)12 個(gè)釀醋企業(yè)的17個(gè)醋糟樣品進(jìn)行了常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析，結(jié)果表明醋糟的NDF、ADF 和木質(zhì)素的含量分別達(dá)到74.98%、52.51%和21.62%，醋糟中CP 平均含量為12.38%，18 種氨基酸均值為9.32%，有機(jī)酸平均含量達(dá)2 273.96 mg/kg，還含有少量磷、鈉、鉀等礦物質(zhì)元素，表明醋糟有被開發(fā)利用的價(jià)值。

紅酵母菌體蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)飼料蛋白質(zhì)，紅酵母發(fā)酵還可產(chǎn)生具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、抗氧化、提高機(jī)體免疫力、改善動(dòng)物繁殖機(jī)能等作用的類胡蘿卜素，紅酵母是生產(chǎn)功能性生物飼料常用菌種之一[11-12]。劉夢(mèng)楊等[13]對(duì)紅酵母菌粉進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示紅酵母無毒性、無致染色體突變等，可減少小鼠腹部脂肪積累。紅酵母是嗜還原糖酵母菌，醋糟中還原糖含量很低，醋糟中的殘留淀粉不易被紅酵母直接吸收利用[14-15]。紅酵母發(fā)酵醋糟所產(chǎn)生的功能性物質(zhì)（類胡蘿卜素）較少，僅為6.60 mg/kg[1]，利用紅酵母發(fā)酵豆腐渣酸解產(chǎn)物，其類胡蘿卜素產(chǎn)量為2.65 mg/kg[16]。

好食脈孢菌發(fā)酵可產(chǎn)生多種酶、蛋白質(zhì)及大量類胡蘿卜素，但產(chǎn)生的蛋白質(zhì)為好食脈孢菌菌體及孢子蛋白質(zhì)，動(dòng)物不易消化吸收。為提高醋糟發(fā)酵產(chǎn)物中的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)含量，同時(shí)提高類胡蘿卜素產(chǎn)量，本研究擬定先進(jìn)行好食脈孢菌發(fā)酵醋糟，以醋糟中蘊(yùn)含的大量CF 為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)好食脈孢菌產(chǎn)生纖維素酶和木聚糖酶，進(jìn)而酶解醋糟中部分CF，提高醋糟中還原糖含量。然后，再利用嗜還原糖的紅酵母發(fā)酵富含還原糖的醋糟好食脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)物，以提高醋糟發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌體蛋白質(zhì)含量。本研究結(jié)果顯示，好食脈孢菌發(fā)酵醋糟所產(chǎn)纖維素酶活性于發(fā)酵72 h 時(shí)達(dá)到最高值，為17.2 U/g，所產(chǎn)木聚糖酶活性于發(fā)酵48 h 時(shí)達(dá)到最高值，為106.3 U/g，在上述酶的共同作用下，發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量提高了88.24%，其機(jī)理可能是好食脈孢菌發(fā)酵醋糟過程中產(chǎn)生的纖維素酶將纖維素分解成葡萄糖，產(chǎn)生的木聚糖酶將木聚糖降解成木糖和低聚糖[17-21]。第一階段發(fā)酵（好食脈孢菌發(fā)酵醋糟）產(chǎn)生了高達(dá)80.1 mg/kg 的類胡蘿卜素，其含量較對(duì)照組提高了27.6 倍；第二階段發(fā)酵（好食脈孢菌與紅酵母協(xié)同發(fā)酵）不僅使醋糟發(fā)酵產(chǎn)物中CP含量與TP 含量分別提高了9.68%與11.70%，而且使類胡蘿卜素產(chǎn)量又提高了12.83%。理論上講，好食脈孢菌與紅酵母協(xié)同發(fā)酵提高的蛋白質(zhì)主要是動(dòng)物易于利用的酵母菌體蛋白質(zhì)，而協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)生的類胡蘿卜素又具有抗氧化、提高機(jī)體免疫力、改善動(dòng)物繁殖機(jī)能等多種作用[22]。但后續(xù)仍需對(duì)本研究獲得的富含蛋白質(zhì)與類胡蘿卜素的發(fā)酵醋糟進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)來驗(yàn)證其飼喂效果。

表2 醋糟樣品發(fā)酵前后重量分析 g

表3 發(fā)酵醋糟樣品營(yíng)養(yǎng)成分含量分析

4 結(jié) 論

好食脈孢菌發(fā)酵醋糟可產(chǎn)生大量類胡蘿卜素，還能產(chǎn)生一定量纖維素酶和木聚糖酶，而這些酶作用于醋糟中的CF，可使醋糟發(fā)酵產(chǎn)物中還原糖含量顯著升高，而后者又為紅酵母發(fā)酵提供了偏好碳源，從而導(dǎo)致好食脈孢菌與紅酵母協(xié)同發(fā)酵醋糟中蛋白質(zhì)含量、類胡蘿卜素含量進(jìn)一步提高。