程薇，楊麗萍，周建獎，謝淵，全欣瑩，陳定宇，王琴容，趙艷**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究中心，貴州 貴陽 550004)

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，亦是癥死亡的第3大原因[1]。近年來，雖然胃癌診斷和治療方面取得了進(jìn)展，但是5年生存率仍然低于30%，即使手術(shù)切除的胃癌患者也有50%～90%的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險[2]。胃癌的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，至今尚不明確，主要影響因素有幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)感染、腫瘤微環(huán)境及基因表達(dá)失調(diào)，而H.pylori感染是重要的始發(fā)因素[3-5]。有研究表明，H.pylori長期感染會引發(fā)急性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等胃部疾病，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。H.pylori細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(cytotoxin associated gene A，CagA)是一種高免疫原性蛋白，分子量為120～140 kDa。細(xì)菌通過cagA毒力島編碼的IV型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system, TFSS)將CagA轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，能與宿主細(xì)胞激酶相互作用，并參與酪氨酸磷酸化修飾[7]；CagA也可以直接以未磷酸化狀態(tài)發(fā)揮作用，從而影響細(xì)胞緊密連接、細(xì)胞極性、細(xì)胞增殖和分化、炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)以及信號傳遞[8]。腫瘤細(xì)胞代謝異常，即使在有氧條件下也偏好糖酵解，稱為Warburg效應(yīng)[9]。腫瘤細(xì)胞Warburg效應(yīng)通常表現(xiàn)為生長迅速，攝取高水平的葡萄糖、谷氨酰胺，糖酵解增強(qiáng)、丙酮酸和乳酸堆積，這些與癌癥的發(fā)生及預(yù)后不良密切相關(guān)[10]。偏好有氧糖酵解能為腫瘤細(xì)胞提供生存優(yōu)勢，但其機(jī)制并不完全清楚。有文獻(xiàn)提示其主要影響因素有代謝酶改變、能量代謝改變、線粒體功能損傷、氨基酸代謝異常、基因失調(diào)、腫瘤微環(huán)境等[11]。研究證明，在肝癌細(xì)胞糖酵解途徑中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的表達(dá)明顯上調(diào)[12]。本實(shí)驗(yàn)建立過表達(dá)glut1穩(wěn)轉(zhuǎn)AGS和BGD823胃癌細(xì)胞株，并用過表達(dá)cagA的腺病毒感染2株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，用免疫熒光檢測過表達(dá)cagA對GLUT1表達(dá)的影響和細(xì)胞定位，為后續(xù)研究CagA引起胃癌細(xì)胞能量變化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞、質(zhì)粒 胃癌細(xì)胞AGS購于ATCC公司(美國)，BGC-823購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，人原代胃癌細(xì)胞YHD由課題組前期分離保存。過表達(dá)CagA腺病毒載體由課題組構(gòu)建和保存。glut1慢病毒載體pCDH-CMV-GLUT1-EF1-turboRFP-T2A-Puro及相應(yīng)的空載體購于上海柯雷達(dá)生物技術(shù)公司，慢病毒的包裝由公司完成。

1.1.2主要試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素/鏈霉素(10 000 U/mL)購于美國Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)、0.25% EDTA胰蛋白酶溶液購于美國Sigma公司，CagA和GLUT1抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，內(nèi)參GAPDH、β-actin抗體，羊抗兔、羊抗鼠辣根過氧化物標(biāo)記二抗，羊抗兔、羊抗鼠熒光二抗均購于美國Proteintech公司，Triton X-100(中國索萊寶公司)，SDS-PAGE蛋白電泳凝膠試劑盒(中國碧云天生物公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher公司(美國)，生物安全柜購于Esco公司(新加披)，Obesever A1型倒置顯微鏡購于蔡司公司(德國)，LSM 710激光共聚焦顯微鏡購于蔡司公司(德國)，-80 ℃ 超低溫冰箱購于海爾公司(中國)，DYY-4C型電泳儀電源購于北京六一生物技術(shù)有限公司(中國)，Mini-Sub cell GT水平電泳槽、Mini-PROTEAN Tetra垂直電泳槽購于Bio-Rad(美國)，高速臺式離心機(jī)、低速臺式離心機(jī)購于Thermo Fisher Scientific(美國)。

1.2 方法

1.2.1過表達(dá)glut1慢病毒感染胃癌細(xì)胞株AGS、BGC823并篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 取對數(shù)生長期的原代胃癌細(xì)胞，以1×106個/孔的細(xì)胞量接種于6孔板，細(xì)胞匯合度至70%～80%，將3 μg過表達(dá)glut1質(zhì)粒和5 μL Lipofectamine 2000分別與200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基混勻，室溫靜置5 min。將質(zhì)粒溶液加入Lipofectamine 2000溶液中，移液槍輕柔吹打混勻，室溫靜置20 min；每孔的培養(yǎng)基更換成0.6 mL不含F(xiàn)BS、雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，再將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴加到相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)孔中、混勻，放于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染6 h后更換成新鮮的DMEM高糖完全培養(yǎng)基。24～48 h后，加入嘌呤霉素，終濃度0.002 mg/L，篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，以空載體慢病毒感染的AGS和BGC823細(xì)胞為對照。

1.2.2Western blot檢測CagA、GLUT1的蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)膜前預(yù)先使用甲醇活化PVDF 膜，根據(jù)目的蛋白分子量大小設(shè)定電壓和時間，轉(zhuǎn)膜結(jié)束，用5% 脫脂奶粉封閉膜2 h，加入相應(yīng)的一抗溶液(稀釋比例均為1 ∶1 000)，置于水平搖床，4 ℃ 孵育過夜。取出PVDF膜，TBST洗膜3次、10 min/次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h；TBST洗PVDF膜3次、10 min/次；將PVDF膜平整放入化學(xué)發(fā)光儀，均勻滴加超敏 ECL化學(xué)發(fā)光試劑，曝光。

1.2.3免疫印跡和免疫熒光鑒定AGS/glut1、BGC-823/glut1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株 培養(yǎng)AGS、BGC-823、BGC-823/glut1、AGS/glut1細(xì)胞，按照1×106個/孔將細(xì)胞接種于15 mm玻底直徑的激光共聚焦皿，用腺病毒以MOI 50感染細(xì)胞48 h；出共聚焦皿，PBS緩沖液洗1次，4%多聚甲醛室溫固定15 min后用PBS緩沖液洗3次、5 min/次；加入0.3% Triton X-100，室溫孵育5～20 min；PBS緩沖液洗/3次、5 min/次，山羊血清室溫封閉1 h，棄掉封閉液，滴加500 μL稀釋好的一抗溶液(1 ∶200)，放入4 ℃ 冰箱孵育過夜。第二天PBS緩沖液洗共聚焦皿3次、5 min/次，滴加500 μL稀釋好的熒光二抗溶液(1 ∶200)，室溫避光孵育1 h。PBS緩沖液洗3次、5 min/次，滴加500 μL DAPI溶液，室溫避光孵育5～10 min，PBS緩沖液洗3次、5 min/次。棄掉皿中溶液，加入200 μL PBS緩沖液，使用LSM 710激光共聚焦顯微鏡采圖。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)CagA降低AGS和人原代胃癌細(xì)胞中GLUT1的表達(dá)

分別用空載體腺病毒(NC)和pAdeno-cagA腺病毒感染AGS和人原代胃癌細(xì)胞YHD 72 h后，免疫熒光檢測GLUT1蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLUT1蛋白主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，且過表達(dá)CagA能引起細(xì)胞膜上GLUT1蛋白的表達(dá)降低并出現(xiàn)碎片化(圖1)。

注：過表達(dá)CagA的AGS、YHD胃癌細(xì)胞免疫熒光鑒定，其中NC為空載組，CagA為過表達(dá)CagA組。

2.2 免疫印跡和免疫熒光鑒定AGS/glut1、BGC-823/glut1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株

為了探討CagA引起GLUT1表達(dá)降低的原因，過表達(dá)glut1慢病毒感染胃癌細(xì)胞株AGS和BGC823，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，Western blot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中GLUT1的表達(dá)。結(jié)果顯示成功構(gòu)建過表達(dá)GLUT1的AGS和BGC-823 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(圖2A)，分別命名為AGS/glut1和BGC-823/glut1。隨后選取BGC-823細(xì)胞用免疫熒光檢測GLUT1蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)BGC-823/glut1細(xì)胞膜上高表達(dá)GLUT1(圖2B)。

注：A示BGC-823/glut1、AGS/glut1細(xì)胞Western blot鑒定，其中MOCK為空白組，pCDH-NC為空載組；B示BGC-823/glut1細(xì)胞免疫熒光鑒定(標(biāo)尺40 μm)，其中NC為空載組，pCDH-glut1為過表達(dá)GLUT1組。

2.3 GLUT1和CagA在細(xì)胞膜上共定位

成功構(gòu)建過表達(dá)GLUT1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株以后，用pAdeno-cagA腺病毒感染BGC-823/glut1和AGS/glut1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，72 h后免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)GLUT1蛋白和CagA均在細(xì)胞膜上表達(dá)，在細(xì)胞膜上共定位(圖3)，提示CagA可能引起細(xì)胞膜的破壞。

圖3 CagA與GLUT1在BGC-823/glut1及AGS/glut1細(xì)胞上的共定位結(jié)果(免疫熒光，標(biāo)尺50 μm)

3 討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤。H.pylori感染可導(dǎo)致急、慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌的發(fā)生[13]。CagA是H.pylori重要毒力因子之一，是哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的首個細(xì)菌性致癌蛋白，亦被稱為細(xì)菌癌蛋白[14]。近年來，雖然對H.pylori進(jìn)行了大量的研究，但是迄今為止H.pylori-CagA對細(xì)胞能量代謝的機(jī)制并不清楚。因此，本研究用過表達(dá)CagA腺病毒感染人胃癌細(xì)胞株AGS和人原代胃癌細(xì)胞YHD，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CagA能夠抑制細(xì)胞膜上GLUT1蛋白的表達(dá)，并且破壞細(xì)胞膜使GLUT1蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)碎片。GLUT是細(xì)胞糖代謝過程中的首個關(guān)鍵蛋白，作為水溶性物質(zhì)的葡萄糖需要借助GLUT通過細(xì)胞磷脂雙分子層轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。GLUT有14個成員，與葡萄糖有高的親和力的是GLUT1，GLUT3和GLUT4，可以高效率地轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖[15]。研究表明，在惡性腫瘤細(xì)胞中，常特征性地過表達(dá)GLUT1或GLUT3[16]。在卵巢癌和肺癌細(xì)胞中，缺氧可誘導(dǎo)氟代脫氧葡萄糖2攝入增加，GLUT1蛋白表達(dá)上調(diào)[17]。

有研究發(fā)現(xiàn)H.pylori感染胃上皮細(xì)胞后，將CagA注入細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞膜內(nèi)磷脂酰絲氨酸結(jié)合，定位在細(xì)胞膜的漿膜面，引起細(xì)胞形態(tài)變化，這可能與胃上皮異常增生和腫瘤惡性程度相關(guān)[18]。本研究中，用免疫熒光共定位檢測發(fā)現(xiàn)CagA和GLUT1共定位于細(xì)胞膜上，推測兩者的共定位是CagA破壞細(xì)胞膜，引起GLUT1表達(dá)碎片化的直接原因。但是，這些結(jié)果與上述腫瘤細(xì)胞中葡萄糖攝取增加的結(jié)果不一致，提示CagA可能通過其它的機(jī)制引起胃癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上，本研究首次證實(shí)CagA與GLUT1共定位于細(xì)胞膜上，破壞細(xì)胞膜，抑制GLUT1蛋白的表達(dá)。該研究將為進(jìn)一步研究CagA對細(xì)胞的毒性以及致病致癌機(jī)制奠定基礎(chǔ)。