周東亞，張海兵，耿曉如，章杭，胡陽(yáng)陽(yáng)，周雷*，王小龍，張璇

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)沭陽(yáng)附屬醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京 223600; 2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤科, 遼寧 錦州 121000)

近年，肺癌的發(fā)病率和死亡率都升高，并成為了中國(guó)乃至世界范圍死亡率最高的惡性腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)的發(fā)病率在肺癌中超過(guò)80%[2]。除了外科手術(shù)外，放射療法也是肺癌最重要的治療方法之一[3-5]，但長(zhǎng)時(shí)間的放射會(huì)使癌癥細(xì)胞產(chǎn)生輻射抗性，致使放療效果減弱[6-7]。因此，尋找一定的靶點(diǎn)以提高NSCLC癌細(xì)胞的放射敏感性，提高放療效果有重要意義。MicroRNA(miRNA)是長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的單鏈RNA，可與靶基因信使RNA(mRNA)序列的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region ,UTR)互補(bǔ)結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[8]。證據(jù)表明，miRNA在包括NSCLC在內(nèi)的癌癥中有重要作用[9-10]，并且相關(guān)研究也指出miRNA可能成為NSCLC治療中的生物標(biāo)志物[6, 11]。據(jù)報(bào)道，miR-605對(duì)肺腺癌有特異性，能通過(guò)抑制肺癌細(xì)胞系中的MDM2來(lái)增強(qiáng)p53的反式激活，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖[12-13]，推測(cè)micro-605的表達(dá)變化是調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞放射敏感性的上游調(diào)控因子，但miR-605與NSCLC細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以NSCLC細(xì)胞A549為對(duì)象探索下調(diào)miR-605靶向調(diào)控腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3,TNFAIP3)，以提高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肺腺癌細(xì)胞A549(中科院上海生命科學(xué)研究所)，miR-605minic和miR-605 inhibitor(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)，qTR-PCR試劑盒(美國(guó)TaqMan公司)，細(xì)胞克隆法試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司)，一抗、二抗(美國(guó)CST公司)，螢光素酶報(bào)告基因試劑盒(美國(guó)Promega公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)，6MV X線直線加速器(德國(guó)西門(mén)子公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染分組 本研究共分為miR-605模擬物組(miR-605 mimic)、miR-605抑制劑組(miR-605 inhibitor)和空白對(duì)照組(NULL)，轉(zhuǎn)染miR-605的A549細(xì)胞模擬物，購(gòu)自于上海GenePharma有限公司。將細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板中，TNFAIP3 cDNA克隆到表達(dá)載體pcDNA3.1(Invitrogen)中構(gòu)建TNFAIP3的過(guò)表達(dá)載體，用RNAiMax和Lipofectamine 3000 with Plus Reagent(Thermo Fisher Scientific)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2miR-605表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR方法檢測(cè)，將miR-605模擬物、miR-605抑制劑、空白對(duì)照轉(zhuǎn)染進(jìn)A549細(xì)胞后miR-605的表達(dá)。按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行qPCR定量相應(yīng)細(xì)胞miR-605的含量，并以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，引物序列如下：GAPDH上游序列為CCCATGTTCGTCATGGGTGT，下游序列為CCCATTCCCCAGCTCTCATA;miR-605 上游序列為UAAAUCCCAUGGUGCCUUCUCC，下游序列為AGAAGGCACUAUGAGAUUUAGA。

1.2.3細(xì)胞克隆法檢測(cè)細(xì)胞活力 照射后的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后進(jìn)行細(xì)胞精確計(jì)數(shù)，選擇合適的稀釋倍數(shù)稀釋后，以每個(gè)培養(yǎng)皿約100個(gè)細(xì)胞的濃度將細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿中，于二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)7 d。用1%甲基藍(lán)對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞染色，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)>50 的克隆數(shù)。細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction，SF)計(jì)算公式：SF(%)=(Sx/S0)×100%，Sx為受照細(xì)胞克隆形成率，S0為對(duì)照細(xì)胞克隆形成率。

1.2.4細(xì)胞凋亡水平實(shí)驗(yàn) 照射后各處理組接種5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，以6 Gy的劑量進(jìn)行照射。24 h后以1 000 r/min離心2次、每次離心5 min，PBS洗滌，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行AV/PI抗體孵育，20 min后分析miR-605模擬物、miR-605抑制劑、NULL組中A549細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western Blot實(shí)驗(yàn) 收集相應(yīng)細(xì)胞，蛋白裂解液中裂解30 min，在4 ℃用12 000 r/min離心15 min。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝(SDS-PAGE)電泳分離等量的蛋白質(zhì)，在4 ℃、300 mA恒流轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，將膜在室溫下、5%脫脂牛奶中封閉1 h，在4 ℃下用TNFAIP3及β-actin一抗過(guò)夜孵育并顯像分析。

1.2.6miRNA靶標(biāo)的分析及熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 使用TargetScan算法對(duì)MiRNA靶標(biāo)進(jìn)行了分析[12]。將各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將0.5 μg TNFAIP3 3′-UTR報(bào)告質(zhì)粒(pRL-TNFAIP3)轉(zhuǎn)染進(jìn)各組經(jīng)miR-605修飾的細(xì)胞中。48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性采用Lipofectamine 2000將含有WT或MT TNFAIP3 3′-UTR的報(bào)告載體與miR-605 mimic或NULL共轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)測(cè)量熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-605表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染進(jìn)miR-605模擬物后，miR-605表達(dá)(3.29±0.13)升高；轉(zhuǎn)染進(jìn)miR-605抑制劑后，miR-605表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染體系有效。見(jiàn)圖1。

注：(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與miR-605模擬物組比較，P<0.05。

2.2 細(xì)胞活力水平

與空白對(duì)照組比較，miR-605模擬物組的細(xì)胞活力升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-605模擬物組比較，miR-605抑制劑組的細(xì)胞活力降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與miR-605模擬物組比較，P<0.05。

2.3 細(xì)胞凋亡水平

照射后，與空白對(duì)照組比較，miR-605模擬物組的細(xì)胞凋亡水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-605模擬物組比較，miR-605抑制劑組的細(xì)胞凋亡升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A1為細(xì)胞照射前凋亡水平，A2為細(xì)胞凋亡水平定量結(jié)果，B1為細(xì)胞照射后凋亡水平，B2為細(xì)胞凋亡水平定量結(jié)果；(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.05;(2)與miR-605模擬物組比較，P<0.05。

2.4 TNFAIP3的蛋白表達(dá)

照射后，與空白對(duì)照組比較，miR-605模擬物組TNFAIP3的蛋白表達(dá)降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-605模擬物組比較，miR-605抑制劑組TNFAIP3的蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.05;(2)與miR-605模擬物組比較，P<0.05。

2.5 靶點(diǎn)和A549細(xì)胞TNFAIP3 3′-UTR的相對(duì)熒光素酶活性

miR-605模擬物能抑制TNFAIP3 3′-UTR報(bào)告基因的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-605抑制劑能提高TNFAIP3 3′-UTR報(bào)告基因的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.05;(2)與miR-605模擬物組比較，P<0.05。

2.6 TNFAIP3 3′-UTR轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力

照射后(6 Gy)，與空白對(duì)照組比較，pcDNA′TNFAIP3轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

注：(1)與空白對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討論

在許多癌癥中，miRNA表達(dá)存在異常。目前相關(guān)研究已指出10個(gè)miRNA是NSCLC的潛在標(biāo)志物，可作為致癌基因或抑癌基因，例如 miRNA-133a能充當(dāng)NSCLC的抑制因子和獨(dú)立的預(yù)后生物診斷標(biāo)志物[14]；miRNA-758可通過(guò)負(fù)調(diào)控HMGB抑制NSCLC的增殖，侵襲，遷移和促凋亡[15]；也有相關(guān)研究指出miRNA同癌細(xì)胞的放射敏感性相關(guān)[6,16-17]。另外，有研究指出，miR-605通過(guò)靶向EN2促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[18]；miR-605通過(guò)靶向抑制PSMD10/Gankyrin金銀抑制了肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的進(jìn)程[19]；并且還有研究指出miR-605通過(guò)直接靶向Forkhead Box P1抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖[20]。然而，miR-605對(duì)NSCLC放射敏感性的影響及相關(guān)機(jī)制仍不清楚。因此，本研究首先通過(guò)細(xì)胞克隆法實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-605 對(duì)A549細(xì)胞放射敏感性的影響，結(jié)果說(shuō)明抑制miR-605在A549細(xì)胞中的表達(dá)有利于提高該細(xì)胞的放射敏感性，而提高miR-605在A549細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)有利于產(chǎn)生輻射抗性。TNFAIP3與非酒精性肝炎有關(guān)，能通過(guò)導(dǎo)肝ASK1的失活改善非酒精性肝炎[21]，而這一結(jié)果仍未有相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。在免疫學(xué)領(lǐng)域，有研究指出TNFAIP3能通過(guò)限制MTOR、促進(jìn)自噬來(lái)提高CD4 T細(xì)胞的活力[22]。本研究通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了miR-605下調(diào)后，靶向上調(diào)了A549細(xì)胞中的TNFAIP3蛋白來(lái)增強(qiáng)其放射敏感性。TNFAIP3基因的高表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),并且與肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)存在相關(guān)性，提示TNFAIP3可能成為協(xié)助非小細(xì)胞肺癌診斷，判斷預(yù)后及療效評(píng)價(jià)的指標(biāo)[23-25]。筆者分析，miRNA表達(dá)抑制可增加經(jīng)γ射線照射(2.5G)的細(xì)胞的死亡，說(shuō)明miRNA有促進(jìn)細(xì)胞存活及抗凋亡的功能。miRNA可通過(guò)不同水平的多種信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)電離輻射引起的細(xì)胞損傷。電離輻射可以激活多種信號(hào)通路損傷細(xì)胞，如MTOR信號(hào)途徑。miR-605的靶基因TNFAIP3對(duì)MTOR信號(hào)途徑有負(fù)調(diào)節(jié)作用，沉默miR-605，增TNFAIP3的表達(dá)，可減少對(duì)DNA雙鏈損傷的修復(fù)，進(jìn)而增加放射敏感性。

綜上所述，下調(diào)miR-605后，非小細(xì)胞肺癌放射敏感性的增強(qiáng)可能是通過(guò)靶向上調(diào)TNFAIP3實(shí)現(xiàn)的，然而由于放射增敏的分子機(jī)制十分復(fù)雜，其是否通過(guò)其他通路產(chǎn)生作用仍不清楚，本研究將對(duì)此不斷探索。