胡玉梅，任真奎,3，郭冬芬，劉穎，吳昌學(xué) **，禹文峰 **

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點實驗室, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550004; 3.黔西南州人民醫(yī)院 檢驗科, 貴州 興義 562400)

Seipin(berardinelli-seip congenital lipodystrophy type 2,BSCL2/Seipin)是由人類先天性全身性脂肪營養(yǎng)不良Ⅱ型基因編碼的非酶蛋白，于1954年首次被發(fā)現(xiàn)[1]，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的非酶蛋白，高表達(dá)于大腦，睪丸及全身脂肪細(xì)胞，在調(diào)節(jié)脂滴的形成、脂肪生成、脂滴穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞甘油三酯脂解過程中都起重要作用[2-4]。在腎相關(guān)疾病研究中發(fā)現(xiàn)，Seipin缺失時會發(fā)生腎脂質(zhì)積聚和出現(xiàn)蛋白尿、產(chǎn)生胰島素抵抗、并調(diào)節(jié)睪丸磷脂穩(wěn)態(tài)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，BSCL2/Seipin在阿爾茨海默病、帕金森(parkinson disease，PD)、腦卒中等疾病中都有重要作用[6-8]，Seipin在PD患者中表達(dá)降低[9-10]；在敲除神經(jīng)細(xì)胞Seipin的小鼠中，小鼠神經(jīng)元增殖能力減弱、運動協(xié)調(diào)方面表現(xiàn)出年齡相關(guān)的缺陷，進(jìn)一步引起α-突觸核蛋白的聚集磷酸化等現(xiàn)象[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)Seipin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)、運動相關(guān)神經(jīng)核內(nèi)亦存在Seipin 陽性神經(jīng)元，推測Seipin可能對PD的形成或發(fā)展有重要作用[13]。在PD細(xì)胞實驗過程中，常用大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(Pheochromocytoma , PC12)構(gòu)建PD細(xì)胞模型[14-15]，本研究通過構(gòu)建Seipin高表達(dá)PC12細(xì)胞，觀察Seipin對PC12細(xì)胞凋亡的影響，并為下一步對PD病研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞及儀器 PC12細(xì)胞(購于中國上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫)，BG-power600電泳儀(BAYGENE)、CSU-W1激光共聚焦顯微鏡(YOKOGAWA)、1730R冷凍高速離心機(jī)(GENESPEED)、ECO實時熒光定量PCR儀(廣東儀濤科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.2實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國gibco公司)、胎牛血清(美國gibco公司)、過表達(dá)慢病毒pHS-AVC-LW1760(北京合生基因科技有限公司)、陰性對照慢病毒pHS-BVC-LW346(北京合生基因科技有限公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)、FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，羅氏)、SDS快速凝膠試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、一抗二抗稀釋液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、Seipin(美國Abcom)、Bax(absin)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(YEASEN)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞用PBS清洗3次、加入0.25%胰酶0.5 mL消化細(xì)胞，1 min后加入2 mL完全培養(yǎng)基(含1%的雙抗和10%胎牛血清的DMEM)終止消化；將培養(yǎng)基吸取吹打培養(yǎng)瓶底部使細(xì)胞完全脫落，吸取細(xì)胞懸液入新的15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min；棄上清，2 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入培養(yǎng)瓶中37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2構(gòu)建Seipin過表達(dá)PC12細(xì)胞 將PC12細(xì)胞以3.0×104個每孔種入12孔板中，分為正常PC12細(xì)胞組(正常組)、陰性對照病毒pHS-BVC-LW346感染組(陰性組)和pHS-AVC-LW1760感染組(Seipin過表達(dá)組)，加入對應(yīng)的慢病毒，同時加入助感染試劑，培養(yǎng)24 h熒光拍照，并將培養(yǎng)液換為含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒帶有紅色熒光和嘌呤霉素抗性篩選基因：細(xì)胞密度適當(dāng)時候換為加含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選具有抗性的細(xì)胞。

1.2.3Real time PCR檢測BSCL2 mRNA表達(dá)水平 取出處理好的細(xì)胞，PBS洗3遍，采用TRIZOL一步法提取RNA，TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，作為Real time PCR模板進(jìn)行下一步或-80 ℃保存。每個樣品取1個200 μL的薄壁管，加入SYBR Green 5 μL、雙蒸水3 μL、上下游引物0.5 μL、模板cDNA 1 μL配制成1 0μL體系，加入PCR板，上機(jī)檢測。

1.2.4Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白BCL2-Associate X蛋白(Bax)的表達(dá) 取出分組處理好的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷PBS洗3次。加入適量細(xì)胞裂解液，將裂解的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入1.5 mL Epp管，置于冰上裂解30 min，該期間每5 min劇烈振蕩15～30 s，12 000 r/min 4 ℃離心10 min。馬上將上清吸取至預(yù)冷的EPP管中。配制標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，SDS蛋白上樣緩沖液混合沸水浴10 min，上樣電泳，30 mA SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴轉(zhuǎn)膜、240 mA恒流2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，TBST漂洗3次，封閉1 h后TBST漂洗3次，一抗4 ℃孵育過夜、TBST漂洗3次，二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗3次進(jìn)行化學(xué)發(fā)光曝光儀曝光，曝光得到圖片用Image J計算目的蛋白和相應(yīng)內(nèi)參的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.5TUNEL試劑盒染色檢測細(xì)胞內(nèi)斷裂DNA情況 向12孔中板內(nèi)放入20 mm的細(xì)胞爬片，將1.0×105個細(xì)胞種入12孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h、棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min。PBS洗2遍每次5 min，加入0.5%的Triton-100通透，孵育20 min，PBS洗2遍每次5 min。陽性對照做預(yù)先處理：加入1×DNase I Buffer 100 μL，孵育5 min后加入每100 μL含有1 U DNA酶I的1×DNase I Buffer 100 μL、孵育10 min，去離子水洗3遍。所有樣本滴加1×Equilibration Buffer 100 μL，室溫下孵育20 min。配制TdT孵育緩沖液，即 ddH2O 34 μL、5×Equilibration Buffer 10 μL、Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix 5 μL、TdT(陰性對照換為雙蒸水)1 μL，將爬片上 1×Equilibration Buffer吸水紙吸除，加入TdT孵育緩沖液50 μL，放入濕盒37 ℃避光孵育1 h。取出PBS洗2遍，加入DAPI封片，Confocal拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 熒光鑒定

通過慢病毒感染PC12細(xì)胞，慢病毒質(zhì)粒帶有RFP熒光，細(xì)胞感染24 h后便可觀察是否出現(xiàn)紅色熒光，初步鑒定感染是否成功，圖1顯示：正常組未加慢病毒感染，不能觀察到紅色熒光，慢病毒載體感染的細(xì)胞陰性組、過表達(dá)組均出現(xiàn)紅色熒光，感染效率在80%以上。

圖1 慢病毒感染后熒光結(jié)果(標(biāo)尺200 μm)

2.2 BSCL2 mRNA表達(dá)

通過提取正常組PC12細(xì)胞、感染后經(jīng)嘌呤霉素篩選后的陰性組和Seipin過表達(dá)組細(xì)胞mRNA做定量分析，Seipin過表達(dá)組BSCL2 mRNA水平相較正常組和陰性組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與正常組和陰性組比較，P<0.01。

2.3 Seipin及Bax蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，通過與正常組和陰性組相比，過表達(dá)組Seipin蛋白表達(dá)量明顯升高；且凋亡相關(guān)蛋白Bax降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

注：A為Western blot蛋白條帶圖，B為Bax條帶灰度值統(tǒng)計圖，C為Seipin條帶灰度值統(tǒng)計圖；(1)與正常組和陰性組比較，P<0.05。

2.4 細(xì)胞核內(nèi)DNA斷裂情況

TUNEL試劑盒檢測細(xì)胞凋亡晚期過程中細(xì)胞核DNA斷裂情況，將斷裂的DNA標(biāo)記上綠色熒光，結(jié)果顯示Seipin過表達(dá)組細(xì)胞核熒光強(qiáng)度相比正常組和陰性組較弱。見圖4。

圖4 TUNEL凋亡試劑盒檢測PC12細(xì)胞凋亡(標(biāo)尺20 μm)

3 討論

Seipin是人類先天性脂肪營養(yǎng)不良2型基因編碼的蛋白，其高表達(dá)于大腦、睪丸、全身脂肪細(xì)胞，并定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是一個有重要的蛋白，目前研究主要圍繞脂質(zhì)代謝、神經(jīng)、腎研究[16-18]。Seipin在大腦中高表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)Seipin與神經(jīng)疾病密切相關(guān)，且Karin等[9-10]對病理確診的PD患者和年齡和性別匹配的正常人死后藍(lán)斑核組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)Seipin在PD患者中表達(dá)量下調(diào)，于是本研究通過構(gòu)建Seipin高表達(dá)組，觀察Seipin表達(dá)量增高后對細(xì)胞凋亡的作用。通過慢病毒感染將帶有紅色熒光蛋白的Seipin過表達(dá)載體導(dǎo)入PC12細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察到紅色熒光，初步判斷載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。通過Real time PCR定量BSCL2 mRNA相對水平，Seipin過表達(dá)組內(nèi)BSCL2 mRNA明顯升高。Western blot檢測Seipin蛋白的表達(dá)水平，Seipin過表達(dá)組Seipin蛋白水平明顯高于正常組和陰性組。Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)水平，過表達(dá)組中Bax較正常組和陰性組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)TUNEL染色觀察到相對正常組和陰性對照組，過表達(dá)組細(xì)胞核內(nèi)斷裂DNA染成綠色的熒光較弱，進(jìn)一步判斷Seipin過表達(dá)后可能對細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建過表達(dá)的PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在Seipin表達(dá)量高的情況該細(xì)胞株的凋亡相關(guān)蛋白Bax及斷裂DNA減少，提示Seipin可能對細(xì)胞有保護(hù)作用，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。