董永麗，史海霞，王 敏，劉全喜

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 101002；2.北京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100039)

腹瀉是由一種或多種病因引起的常見(jiàn)消化道疾病癥狀，可根據(jù)病程分為急性腹瀉和慢性腹瀉兩類(lèi)，臨床多表現(xiàn)為排便次數(shù)增多，糞便量增加，便溏稀，大便可伴有黏液、膿血或未消化的食物[1-2]。西醫(yī)常用治療方式主要集中在使用相關(guān)抗生素、止瀉藥物、補(bǔ)液糾正水電解質(zhì)和酸堿失衡的對(duì)癥和營(yíng)養(yǎng)支持治療[2]。針對(duì)慢性腹瀉的治療，長(zhǎng)期使用化學(xué)類(lèi)藥物會(huì)加速腸道病原菌耐藥性的產(chǎn)生，不利于后期臨床獲益[3]。

中藥具有毒性低，不易產(chǎn)生耐藥性，其含有的多種天然有效活性成分可起到多靶點(diǎn)、多途徑、協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)，使腹瀉治療相關(guān)中藥復(fù)方成為本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。腹瀉在中醫(yī)屬“泄瀉”范疇，又稱(chēng)“下利”“飧泄”“注泄”等，可從外感、內(nèi)傷分為多種不同證候類(lèi)型，基本病機(jī)為脾胃受損、濕困脾土導(dǎo)致腸道功能失調(diào)[4-5]。葛根芩連湯出自《傷寒論》，外可解肌表之邪，內(nèi)可清陽(yáng)明之熱[6]。研究表明，葛根芩連湯在治療腹瀉方面有顯著療效，針對(duì)小兒輪狀病毒感染性腸炎，葛根芩連湯可顯著縮短小兒腹瀉、發(fā)熱及嘔吐時(shí)間[7-9]。對(duì)于急性胃腸炎，葛根芩連湯高于90%的有效率與單純使用西藥治療相比優(yōu)勢(shì)明顯[10-11]。潰瘍性結(jié)腸炎患者在服用葛根芩連湯治療后，臨床癥狀緩解較快，血常規(guī)的白細(xì)胞及便常規(guī)的紅白細(xì)胞計(jì)數(shù)也在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)至正常水平[12-14]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯的組成藥物含有的有效中藥成分包括異黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、甘草酸等，之所以能夠快速有效的發(fā)揮止瀉作用可能與其多成分多靶點(diǎn)作用有關(guān)[15-17]。同時(shí)，葛根芩連湯中的葛根素和黃芩苷還具有良好的抗炎作用，能降低多種致炎因子的血清含量[18-19]，還能通過(guò)抑制乙酰膽堿所致的腸道過(guò)強(qiáng)蠕動(dòng)達(dá)到止瀉的目的[20]。由此可見(jiàn)，葛根芩連湯在治療腹瀉中顯示的良好療效與中藥多成分多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮作用密不可分，因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究葛根芩連湯治療腹瀉的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療臨床疾病提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 葛根芩連湯中藥復(fù)方的有效化學(xué)成分及潛在靶點(diǎn)的確定 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)(Traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)分別確定“葛根”“黃芩”“黃連”“甘草”四個(gè)藥物的所有化學(xué)成分，定義藥物口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和類(lèi)藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18，篩選活性較高的化學(xué)成分。通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索各靶點(diǎn)人類(lèi)基因的簡(jiǎn)稱(chēng)，明確葛根芩連湯潛在靶點(diǎn)。

1.2 腹瀉疾病相關(guān)靶點(diǎn)的查詢(xún) 以“Diarrhea”為關(guān)鍵詞依次檢索OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGeNET疾病數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取腹瀉目前確定的所有疾病靶蛋白。利用Venny2.1在線軟件刪除三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)重復(fù)的疾病靶點(diǎn)，確定最終的疾病靶點(diǎn)。

1.3 葛根芩連湯-腹瀉共同作用靶點(diǎn)的確定及關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用在線繪圖軟件Venny 2.1整合藥物與疾病的共同靶點(diǎn)，確定葛根芩連湯與腹瀉的共同靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。利用Cytoscape 3.7.1繪圖軟件構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，使葛根芩連湯作用于腹瀉的靶點(diǎn)關(guān)系可視化。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將葛根芩連湯與腹瀉的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0在線軟件，設(shè)置蛋白種類(lèi)為“homo sapiens”，獲得蛋白互作信息圖。根據(jù)蛋白作用關(guān)系調(diào)整置信度蛋白質(zhì)參數(shù)，初步設(shè)置參數(shù)為>0.7，確保研究數(shù)據(jù)的可靠性。

1.5 基因本體功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(shū)通路富集分析 基因本體(Gene ontology，GO) 是基因本體論聯(lián)合會(huì)建立的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，旨在建立一個(gè)適用于各種物種的、對(duì)基因和蛋白功能進(jìn)行限定和描述的語(yǔ)義詞匯標(biāo)準(zhǔn)。GO注釋分為三大類(lèi)，分別是：分子生物學(xué)功能(Molecular function，MF)、生物學(xué)過(guò)程(Biological process，BP)和細(xì)胞學(xué)組分(Cellular components，CC)。通過(guò)Metascape基因注釋軟件，對(duì)與腹瀉相關(guān)的葛根芩連湯藥對(duì)“活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行GO功能富集分析。京都基因與基因組百科全書(shū) (Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。KEGG分析目的在于對(duì)探討治療腹瀉的生物學(xué)過(guò)程及關(guān)鍵信號(hào)通路。通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件中的“Clue GO”插件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，獲得顯著富集的信號(hào)通路(P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 葛根芩連湯化學(xué)成分及潛在靶點(diǎn)的確定 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)初步檢索到已知的葛根芩連湯有效活性成分489個(gè)，其中符合條件的化學(xué)成分共146個(gè)，刪除重復(fù)的后共剩余121個(gè)，按照類(lèi)藥性的大小依次降序排列排名前20的生物活性成分，見(jiàn)表1。

2.2 葛根芩連湯與腹瀉疾病共同靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 將以上121種生物活性成分使用TCMSP靶點(diǎn)預(yù)測(cè)指令進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。其中葛根47個(gè)，黃芩85個(gè)，黃連158個(gè)，甘草199個(gè)，去除重復(fù)共獲得221個(gè)靶蛋白。經(jīng)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET查詢(xún)腹瀉相關(guān)靶點(diǎn)共5555個(gè)，查重后獲得5217個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)Venny取交集得到葛根芩連湯中參與腹瀉的靶點(diǎn)182個(gè)(圖1)。

表1 葛根芩連湯部分生物活性成分(前20名)

2.3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)確定及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的共同靶利用Cytoscape 3.7.1網(wǎng)絡(luò)繪圖軟件繪制并分析葛根芩連湯干預(yù)腹瀉成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。紅色多邊形表示疾病，黃色箭頭代表葛根芩連湯活性成分，綠色橢圓表示各成分基因靶點(diǎn)，藍(lán)色菱形表示葛根芩連湯的藥物組成，作用關(guān)系分別用藍(lán)色、黃色、紅色線條連接。該網(wǎng)絡(luò)包括節(jié)點(diǎn)289個(gè)，靶點(diǎn)間共存在3500條相互作用線(圖2)。

圖1 藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 葛根芩連湯腹瀉靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及聚類(lèi)分析 通過(guò)STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)在線檢索蛋白質(zhì)(已知蛋白和預(yù)測(cè)蛋白)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，初步構(gòu)建葛根芩連湯治療腹瀉的PPI網(wǎng)絡(luò)圖形，在Export模塊中，導(dǎo)出PNG格式的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，文本文件保存為T(mén)SV。將STRING 11.0構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape軟件的MCODE插件利用網(wǎng)絡(luò)聚類(lèi)算法，對(duì)相應(yīng)的功能模塊進(jìn)行美化調(diào)整，直觀的反應(yīng)葛根芩連湯干預(yù)腹瀉的作用機(jī)制。其中利用STRING 11.0構(gòu)建的蛋白網(wǎng)絡(luò)共包括：該網(wǎng)絡(luò)圖中包含182個(gè)，1388條關(guān)系線條，預(yù)期邊緣356個(gè)，PPI濃縮p<1.0e-16，進(jìn)一步聚類(lèi)分析預(yù)測(cè)出葛根芩連湯中的AKT1、CASP3、JUN、PTGS2、RELA、ESR1可能為治療腹瀉的核心關(guān)鍵蛋白(圖3)。

圖2 藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 核心蛋白柱狀圖

2.5 生物通路富集分析 GO富集分析顯示(圖4),生物過(guò)程確定了157個(gè)GO條目，主要包括生物調(diào)節(jié)(Biological regulation)、細(xì)胞代謝(Neurotransmitter metabolism)、蛋白質(zhì)結(jié)合(Protein binding)、離子結(jié)合(Ion binding)、信號(hào)受體結(jié)合(Signaling receptor binding)。

KEGG 信號(hào)通路分析結(jié)果(圖5),共確定167條信號(hào)通路，通路圖像中的富集程度用顏色深淺來(lái)表示，顏色越深說(shuō)明富集程度越好，不同顏色節(jié)點(diǎn)表示不同通路。葛根芩連湯治療腹瀉的核心靶點(diǎn)主要通過(guò)IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡與衰老信號(hào)通路作用于疾病。

圖4 葛根芩連湯藥對(duì)干預(yù)腹瀉GO分析柱狀圖

圖5 葛根芩連湯藥對(duì)干預(yù)腹瀉KEGG分析柱狀圖

3 討 論

腹瀉是消化系統(tǒng)疾病最常見(jiàn)的疾病之一，腹瀉的影響因素眾多，西醫(yī)治法以對(duì)癥治療為主，治療方案局限，尤其是針對(duì)長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的慢性腹瀉，單一西藥無(wú)法取得滿(mǎn)意的臨床療效[21]。葛根芩連湯是中醫(yī)臨床治療急慢性腸炎、細(xì)菌性痢疾等具有腹瀉癥狀的胃腸疾病的經(jīng)方，尤善于祛除濕熱濁邪[22]。本方以性甘涼，歸胃經(jīng)的葛根為君藥，升發(fā)脾胃清陽(yáng)之氣，促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)排泄糟粕；以黃連、黃芩為臣藥，取二者苦寒之性起到燥濕止瀉的目的，又可兼顧調(diào)暢肝膽氣機(jī)，使?jié)駸嶂安灰综諟灰愿示徍椭械母什轂樽羰顾幷{(diào)和諸藥藥性，四藥共奏外疏內(nèi)清之功[23]。葛根芩連湯以其精妙的組方及明確的療效，廣泛應(yīng)用于臨床，但其作用機(jī)制尚未完全明確，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種能夠?yàn)橹嗅t(yī)學(xué)從基于經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)邁向基于證據(jù)的醫(yī)學(xué)提供新的途徑的強(qiáng)大工具[24-25]。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，構(gòu)建中藥與疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，挖掘葛根芩連湯中的復(fù)雜成分之間的聯(lián)系，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度為葛根芩連湯的組方及療效作用進(jìn)行了新的科學(xué)解析。

葛根芩連湯首載于《傷寒論》：“太陽(yáng)病，桂枝證，醫(yī)反下之，利遂不止，脈促者，表未解也；喘而汗出者，葛根黃芩黃連湯主之”。本方有解表清里之功，主治身熱下利，胸脘煩熱，口中作渴，喘而汗出的病證，為太陽(yáng)、陽(yáng)明經(jīng)藥。君藥葛根的主要化學(xué)成分包括異黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、生物堿類(lèi)、芳香類(lèi)等類(lèi)別有效成分，具有增加血流量、改善微循環(huán)、緩解肌肉緊張、增強(qiáng)免疫力、減輕發(fā)熱、抑制炎癥反應(yīng)的作用[26-27]。黃芩、黃連中藥物主要化學(xué)成分為黃芩素類(lèi)、漢黃芩苷、黃芩黃酮、木蝴蝶素、生物堿、木脂素、香豆素、萜類(lèi)、甾體、有機(jī)酸、揮發(fā)油、多糖等[28]。通過(guò)TCMSP篩選發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯主要通過(guò)芒柄花黃素(Formononetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、3’-甲氧基大豆素(3’-methoxydaidzein)、大豆甙元-4’，7-二葡萄糖甙(Daidzein-4’，7-diglucoside)的AKT1、CASP3、JUN、PTGS2等核心靶點(diǎn)的IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡與衰老信號(hào)通路等通路作用于腹瀉相關(guān)疾病。

通過(guò)構(gòu)建葛根芩連湯“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，得出葛根芩連湯的有效成分121個(gè)，基因靶點(diǎn)221個(gè)，其中作用于腹瀉的潛在基因?yàn)?82個(gè)，占全部靶點(diǎn)的80%以上，驗(yàn)證了葛根芩連湯中藥復(fù)方的臨床有效性。脾主運(yùn)化，胃主儲(chǔ)藏腐熟水谷，小腸主分清別濁，大腸主傳導(dǎo)，臟腑協(xié)調(diào)則氣機(jī)條達(dá)。葛根走脾、胃二經(jīng)，黃芩、黃連苦寒，主清利腸道，甘草甘緩止痛，有降低腸道蠕動(dòng)，抑制機(jī)體炎性反應(yīng)，修復(fù)、重建損傷的腸道平衡的功效[29]?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，葛根芩連湯的抗病毒、抗菌、增強(qiáng)免疫力的作用，能夠明顯縮短濕熱型急性感染性腹瀉的病程，避免抗生素使用不當(dāng)而繼發(fā)菌群失調(diào)[30]。葛根芩連湯治療腹瀉的核心靶點(diǎn)主要包括AKT1、CASP3、JUN、PTGS2、RELA、ESR1等靶點(diǎn)基因，通過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn)主要參與DNA、RNA的轉(zhuǎn)錄，聚合酶Ⅱ特異性，細(xì)胞因子受體結(jié)合，酶與輔酶的結(jié)合，酰胺結(jié)合過(guò)程。說(shuō)明葛根芩連湯對(duì)于腹瀉的治療作用主要是通過(guò)抑制炎性基因的酶活性，調(diào)控炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，完成細(xì)胞修復(fù)與再生，從分子層面上消除腹瀉相關(guān)癥狀，符合中醫(yī)治病求本的辨證診療思路。

KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯作用通路主要分為病毒感染相關(guān)通路、細(xì)菌感染與修復(fù)相關(guān)通路、癌癥相關(guān)通路以及細(xì)胞再生與修復(fù)通路。其中，Salmonella infection、Shigellosis和Pathogenic Escherichia coli infection信號(hào)通路均為常見(jiàn)的細(xì)菌性痢疾通路，分別為沙門(mén)桿菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌作用通路，其中葛根芩連湯的潛在三者的作用靶點(diǎn)均在20個(gè)以上，主要通過(guò)抗炎免疫、抑制腸道平滑肌收縮，緩解腹瀉、腹痛的癥狀；PI3K-Akt信號(hào)通路可能通過(guò)降低腸道組織黏膜水腫和微血管通透性，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性胃腸炎癥具有保護(hù)作用[31]。IL-17信號(hào)通路屬于炎癥介導(dǎo)通路，主要通過(guò)活化T細(xì)胞、刺激Th17的分泌，加快成纖維細(xì)胞、IL-6等細(xì)胞因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，引起腸道內(nèi)環(huán)境的破壞[32]。TNF、Apoptosis和Cellular senescence信號(hào)通路與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，發(fā)生病變的胃腸道黏膜通過(guò)釋放TNFα等細(xì)胞因子，活化巨噬細(xì)胞，促使的細(xì)胞毒作用的發(fā)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[33-34]。其他相關(guān)性較高的信號(hào)通路，目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步探索，以證實(shí)其作用機(jī)制。

對(duì)于腹瀉的治療應(yīng)堅(jiān)持中西并用，傳承創(chuàng)新，充分發(fā)揮中西醫(yī)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，最大利用中藥復(fù)方多靶點(diǎn)，多功效的特點(diǎn)。葛根芩連湯治療腹瀉的靶點(diǎn)復(fù)雜，通路多樣，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步明確了葛根芩連湯的抗炎免疫機(jī)制，主要起到抗炎、緩解肌肉痙攣的作用，具體分子機(jī)制尚未驗(yàn)證，后期完善需要借助分子對(duì)接及分子生物學(xué)研究，完善葛根芩連湯的作用機(jī)制，明確葛根芩連湯治療腹瀉的核心通路。