王怡云,石麗敏,謝俊霞

(青島大學(xué)腦科學(xué)與疾病研究院(山東省神經(jīng)相關(guān)疾病的機(jī)制與防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省沿海地區(qū)神經(jīng)退變疾病協(xié)同創(chuàng)新中心),山東 青島 266071)

帕金森病(PD)是全球第二大神經(jīng)退行性疾病，其病理特征為中腦黑質(zhì)(SN)區(qū)多巴胺(DA)能神經(jīng)元選擇性死亡，殘存的DA能神經(jīng)元出現(xiàn)以α-突觸核蛋白(α-syn)為主要成分的路易小體[1-3]。PD主要的臨床癥狀有靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、姿勢反射障礙等[4-6]。但到目前為止，PD病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與遺傳、環(huán)境、鐵沉積、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等原因有關(guān)[7-11]。鉀通道是目前發(fā)現(xiàn)的亞型最多、功能最復(fù)雜、分布最廣的一類離子通道，幾乎存在于所有生物體中[12]。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，鉀通道的異常表達(dá)可能對(duì)PD有一定的調(diào)控作用[13]。A型鉀通道是電壓依賴型鉀通道的一個(gè)重要分支，在調(diào)控DA能神經(jīng)元的動(dòng)作電位、放電模式和放電頻率上具有重要的作用[14]。A型鉀通道共有5種亞型，有研究表明，Kv4.3 A型鉀通道在SN區(qū)DA能神經(jīng)元上廣泛表達(dá)[15]。有研究對(duì)PD病人殘存的DA能神經(jīng)元進(jìn)行PCR分析，發(fā)現(xiàn)Kv4.3mRNA表達(dá)明顯升高[16]，而阻斷A型鉀通道可以改善PD病人[17]以及PD大鼠模型[18]的運(yùn)動(dòng)功能障礙。然而，在PD疾病進(jìn)展過程中A型鉀通道的表達(dá)變化目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在攜帶人A53T突變型α-syn的轉(zhuǎn)基因小鼠(α-SynA53T+/+小鼠)上，應(yīng)用蛋白免疫印跡方法檢測了不同月齡的α-SynA53T+/+小鼠以及同窩野生型(WT)小鼠SN區(qū)Kv4.3和酪氨酸羥化酶(TH)蛋白的表達(dá)水平，探究在PD的進(jìn)展過程中A型鉀通道的變化，為PD提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所用A53T轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室。α-SynA53T+/-小鼠與α-SynA53T+/-小鼠雜交得到下一代小鼠，通過基因組鑒定得到α-SynA53T+/+小鼠、α-SynA53T+/-小鼠及相對(duì)應(yīng)的同窩WT小鼠。本實(shí)驗(yàn)選用3月齡和15月齡α-SynA53T+/+小鼠和同窩WT小鼠作為研究對(duì)象，每組6只。小鼠飼養(yǎng)條件：室溫(21±2)℃，濕度(50±5)%，12 h晝夜循環(huán)光照，可自由飲水、取食。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 Kv4.3抗體購自中國Absin公司，TH抗體購自美國Millipore公司，β-actin抗體購自中國博奧森公司。山羊抗兔二抗購自中國Absin公司。分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液均購于康為公司，ECL發(fā)光液、PVDF膜購自美國Millipore公司，APS、TEMED、RIPA裂解液、BCA試劑盒、Loading buffer購自中國碧云天公司。電泳儀、電轉(zhuǎn)儀購自美國BioRad公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP公司。

1.2 蛋白免疫印跡法檢測SN區(qū)TH和Kv4.3蛋白的表達(dá)

小鼠用100 g/L水合氯醛麻醉后快速斷頭取腦，完整地取出包括中腦SN區(qū)的腦組織，置于冰盒內(nèi)，取出雙側(cè)SN區(qū)域，分別放入預(yù)冷的1.5 mL EP管中，準(zhǔn)確稱質(zhì)量。加入蛋白裂解液充分研磨后，于冰上靜置30 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，應(yīng)用BCA法，測定波長562 nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品的蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，按照樣品上樣量準(zhǔn)確上樣，蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完成后，將目的條帶完整切下，用50 g/L的脫脂奶粉于室溫?fù)u床上封閉2 h；分別加入一抗Kv4.3(1∶1 000)、TH(1∶3 000)以及β-actin(1∶10 000)，于4 ℃搖床上低速搖動(dòng)孵育過夜。用TBST洗3次，每次10 min，加山羊抗兔(1∶10 000)的二抗在室溫下孵育1 h，用TBST洗3次，每次10 min。于ECL顯色試劑盒中取適量發(fā)光液均勻滴在PVDF膜上，室溫孵育1 min，用UVP凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖片。在Image J圖像采集與分析軟件上對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析。用Kv4.3、TH蛋白與β-actin的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同月齡α-Syn A53T+/+小鼠SN區(qū)Kv4.3蛋白表達(dá)比較

α-SynA53T+/+組和WT組3月齡小鼠Kv4.3蛋白表達(dá)水平分別為0.965±0.040和0.844±0.084(n=6)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.402，P>0.05)。α-SynA53T+/+組和WT組15月齡小鼠Kv4.3蛋白表達(dá)水平分別為1.855±0.101和1.343±0.124(n=5)，α-SynA53T+/+組Kv4.3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.202，P<0.05)。

2.2 不同月齡α-Syn A53T+/+小鼠SN區(qū)TH蛋白表達(dá)變化

α-SynA53T+/+組和WT組3月齡小鼠TH蛋白表達(dá)水平分別為1.030±0.099和0.928±0.135(n=5)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.612，P>0.05)。α-SynA53T+/+組和WT組15月齡小鼠TH蛋白表達(dá)水平分別為1.586±0.1205和1.975±0.1008(n=6)，α-SynA53T+/+組TH表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.475，P<0.05)。

3 討 論

近年來的研究顯示，PD的發(fā)病可能與鉀離子通道功能異常有關(guān)，以鉀離子通道為靶點(diǎn)來治療PD也成為一個(gè)重要的研究方向[19]。鉀離子通道廣泛存在于神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、紅細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞中[20-21]。A型鉀通道是一種電壓依賴型鉀通道，又稱瞬時(shí)外向型鉀通道，在SN區(qū)DA能神經(jīng)元上有廣泛的表達(dá)，可影響神經(jīng)元的自發(fā)放電[22-24]。該通道介導(dǎo)的電流具有瞬時(shí)出現(xiàn)、快速激活、快速失活等特點(diǎn)[25-26]。A型鉀通道由Kv4基因家族形成的α亞基和KChip基因家族形成的輔助β亞基共同組成，其中在SN區(qū)DA能神經(jīng)元上主要表達(dá)的是Kv4.3/KChip3.1[27-29]。然而，在PD的SN區(qū)DA能神經(jīng)元退行性變過程中，A型鉀通道究竟發(fā)揮了何種作用尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)選取α-SynA53T+/+小鼠作為動(dòng)物模型，該模型可用來研究PD發(fā)病過程中運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)行為的改變[30]。本文研究結(jié)果顯示，3月齡的A53T轉(zhuǎn)基因小鼠SN區(qū)Kv4.3及TH蛋白的表達(dá)水平尚未發(fā)生明顯變化，提示3月齡的A53T轉(zhuǎn)基因小鼠SN區(qū)并無損傷，A型鉀通道也尚未發(fā)生變化。有文獻(xiàn)報(bào)道，3月齡A53T轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力無明顯障礙，但認(rèn)知功能出現(xiàn)一定程度的下降[31]。另有研究表明，A53T轉(zhuǎn)基因小鼠在8月齡時(shí)才出現(xiàn)明顯的總體運(yùn)動(dòng)功能障礙，表現(xiàn)為毛發(fā)梳理減少、移動(dòng)減少，在12月齡時(shí)表現(xiàn)出步幅的縮短和速度的減慢[32-33]。本研究在15月齡的A53T轉(zhuǎn)基因小鼠SN區(qū)檢測到，Kv4.3蛋白的表達(dá)顯著升高，TH蛋白的表達(dá)顯著降低，說明SN區(qū)的DA能神經(jīng)元出現(xiàn)了一定程度的損傷，A型鉀通道的表達(dá)也出現(xiàn)了異常，該結(jié)果與以往研究PD病人存活的SN區(qū)DA能神經(jīng)元中Kv4.3mRNA的表達(dá)顯著增加相吻合[16]。

鉀離子通道的表達(dá)及功能異常通過多種機(jī)制影響SN、紋狀體的功能，從而在PD的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。例如，近期已有研究結(jié)果顯示，鈣激活型鉀通道KCa3.1在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的PD小鼠模型SN區(qū)表達(dá)顯著增加，基因敲除或用通道阻斷劑藥理干預(yù)能有效拮抗MPTP誘導(dǎo)的SN區(qū)DA能神經(jīng)元損傷及紋狀體DA含量下降，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞增生所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[34]。ATP敏感性鉀通道(KATP)的SUR1亞單位在PD小鼠模型SN區(qū)的表達(dá)也顯著增高[35]，激活KATP可以導(dǎo)致DA能細(xì)胞內(nèi)鐵含量增加，損傷線粒體功能并增加細(xì)胞氧化應(yīng)激[36]。本實(shí)驗(yàn)首次證明，在15月齡的A53T轉(zhuǎn)基因小鼠SN區(qū)A型鉀通道Kv4.3蛋白表達(dá)增加。A型鉀通道是調(diào)節(jié)SN區(qū)DA能神經(jīng)元興奮性的關(guān)鍵因素，可影響突觸傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。我們的前期研究已經(jīng)觀察到，A型鉀通道阻斷劑4-氨基吡啶可以抑制A型鉀通道電流，增加SN區(qū)DA能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率[37]；腹腔注射4-氨基吡啶能顯著縮短MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型爬桿實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)頭和爬桿的時(shí)間，改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙[38]。因此，我們推測，在PD的進(jìn)展過程中，A型鉀通道的表達(dá)及功能發(fā)生改變，影響SN區(qū)神經(jīng)元的興奮性，進(jìn)而改變了紋狀體DA的釋放，從而影響機(jī)體的運(yùn)動(dòng)功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為闡明A型鉀通道參與PD發(fā)病提供了初步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。