屈蓉，吳康，吳娟，范小勇，呂建新

1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州325035；

2.上海市（復(fù)旦大學(xué)附屬）公共衛(wèi)生臨床中心，上海201508

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的以呼吸系統(tǒng)受累為主的傳染病。2018年，全球新增約1 000萬(wàn)TB病例，其中約145萬(wàn)患者死亡，TB是全球單一感染病原菌所致疾病中致死人數(shù)最多的疾?。?］。因此，早期且快速診斷和及時(shí)有效治療是消除傳染源、控制TB的關(guān)鍵。

目前，TB診斷的主要方法有胸部X線(xiàn)檢查、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)（痰涂片抗酸染色和細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法）、PPD皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin test，TST）及核酸擴(kuò)增分子生物學(xué)檢測(cè)等綜合方法。細(xì)菌培養(yǎng)是TB診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，僅靠其判斷會(huì)影響患者的及時(shí)治療［2］。PPD皮試是一種臨床常用的免疫學(xué)皮試檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，但無(wú)法明確區(qū)分卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）免疫、環(huán)境NTM（nontuberculosis mycobacteria）感染和致病性Mtb感染，鑒別診斷價(jià)值不高，且影響因素較多，易出現(xiàn)較高的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果［3］。以Gene-Xpert為代表的核酸擴(kuò)增技術(shù)在早期診斷中發(fā)揮日益重要的作用，正成為T(mén)B病原學(xué)診斷方法的一種重要補(bǔ)充，但其成本和對(duì)檢測(cè)環(huán)境的嚴(yán)格要求限制了其在基層醫(yī)院的廣泛使用［4］。因此，尋找靈敏度和特異性俱佳的Mtb抗原并將其運(yùn)用至血清學(xué)檢測(cè)，仍是TB早期檢測(cè)及其鑒別診斷的一個(gè)重要手段。

MPT64存在于Mtb活躍復(fù)制的細(xì)菌細(xì)胞中，在培養(yǎng)初期大量分泌，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而減少［5］。MPT64不存在于弱毒性的BCG菌株中，提示其可能是Mtb毒力相關(guān)因子。MPT64參與機(jī)體與免疫系統(tǒng)的相互作用［6-7］，可誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，有可能作為診斷活動(dòng)性結(jié)核的標(biāo)志物［8］。本研究原核表達(dá)、純化了重組MPT64蛋白，并初步探討了其在TB血清學(xué)診斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及蛋白 大腸埃希菌克隆菌株Top10及表達(dá)菌株BL21（DE3）、原核表達(dá)載體pET28a（+）、Mtb標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組、重組GroES蛋白、重組Ag85A蛋白均由上海市公共衛(wèi)生臨床中心結(jié)核病感染與免疫課題組保存。

1.2 血清樣本44份患者血清由上海市公共衛(wèi)生臨床中心于2020年1—8月收集，均為經(jīng)臨床表現(xiàn)及X線(xiàn)檢查或細(xì)菌學(xué)檢查、病理組織學(xué)檢查等確診為T(mén)B的病例，設(shè)為T(mén)B組。健康對(duì)照組［HC（healthy control）組］血清收集自該中心的36名體檢健康人群，均無(wú)TB密切接觸史，無(wú)臨床癥狀，胸片檢查無(wú)異常表現(xiàn)。

1.3 主要試劑及儀器 限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、Pfu DNA Polymerase和低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)均購(gòu)自立陶宛MBI Fermentas公司；HRP標(biāo)記的鼠抗人IgA和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為北京博奧龍生物技術(shù)公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體為美國(guó)BETHYL公司產(chǎn)品；親和層析所用介質(zhì)Ni-NTA Sepharose（Ni2+-NTA親和柱）為美國(guó)GE Healthcare公司產(chǎn)品；Protein G柱購(gòu)自中科森輝微球技術(shù)（蘇州）有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)新西蘭大白兔，雌性，8周齡，體重2 kg，購(gòu)自上海甲干生物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)為：20150005004191。

1.5mpt64基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中登錄的mpt64基因序列（AY208674）設(shè)計(jì)引物，上游引物F：5′-CGCGGATCCATGCGCCCAAGACCTACTGCGAG-3′（下劃線(xiàn)部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物R：5′-CCGGAATTCCTAGGCCAGCATCGAGTCGA-3′（下劃線(xiàn)部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段大小為687 bp。以H37Rv基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增mpt64基因。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性1 min；98℃15 s，58℃15 s，68℃30 s，共30個(gè)循環(huán)；68℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物及pET28a（+）質(zhì)粒，膠回收酶切產(chǎn)物，載體與mpt64基因片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性單克隆，抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）鑒定正確后，送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，鑒定正確質(zhì)粒命名為pET28a-mpt64。

1.7 重組MPT64蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-mpt64轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），挑取陽(yáng)性單克隆接種于含50μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；再以2%比例轉(zhuǎn)種至200 mL LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至A600約0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol／L的IPTG，37℃誘導(dǎo)過(guò)夜；8 000×g離心10 min，收獲菌體，PBS重懸，超聲碎菌，收集全菌裂解液、離心后的上清和沉淀，進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.8 重組MPT64蛋白的純化 將重組菌大量培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)并超聲破碎，離心后收集上清，經(jīng)Ni2+-NTA親和柱純化。用不同咪唑濃度（25、50、100、150、250和500 mmol／L）的洗脫液（含50 mmol／L Tris-HCl，100 mmol／L NaCl）逐步洗脫，收集洗脫液，12%SDS-PAGE分析。收集純度較高的幾管洗脫液，透析除去鹽類(lèi)及咪唑，BCA測(cè)定濃度，1 mL／管分裝保存。

1.9 MPT64兔多克隆抗血清的制備 將純化的MPT64蛋白600μg與弗氏完全佐劑1∶1混合，皮下多點(diǎn)免疫新西蘭大白兔，隔周免疫1次，共4次。第2、4、6周與弗氏不完全佐劑1∶1混合加強(qiáng)免疫，2周后，耳緣靜脈采血，分離血清，-80℃保存。間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)：用2μg／mL MPT64蛋白包被ELISA板，4℃孵育過(guò)夜；3% BSA-PBS室溫封閉1 h；加入血清［PBS 10倍系列稀釋?zhuān)?02～106）］，室溫2 h；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋?zhuān)?，室溫孵?0 min；TMB顯色。免疫4次后，動(dòng)脈取血，經(jīng)Protein G柱純化兔多克隆抗血清。

1.10 重組MPT64蛋白的抗原特異性鑒定 采用Western blot法。將純化的重組蛋白經(jīng)12% SDSPAGE分離后，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入重組MPT64蛋白兔多克隆抗血清（1∶5 000稀釋?zhuān)?℃孵育1 h；TBST緩沖液（含1×TBS，0.05% Tween 20）洗滌，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋?zhuān)覝胤跤? h；TBST洗滌，ECL顯影。

1.11 抗原的血清學(xué)評(píng)價(jià) 采用間接ELISA法測(cè)定TB組44份和HC組36份血清中抗MtbIgG或IgA抗體水平。分別以5μg／mL MPT64、GroES和Ag-85A蛋白包被ELISA板，100μL／孔，4℃包被過(guò)夜；3% BSA-PBS封閉，加入MPT64兔多克隆抗血清（PBS 1∶2 000稀釋?zhuān)?00μL／孔，室溫2 h；加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG（1∶20 000稀釋?zhuān)┗騂RP標(biāo)記的鼠抗人IgA（1∶5 000稀釋?zhuān)?，室溫孵?0 min；加入TMB，室溫顯色5 min；酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處A值。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1mpt64基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定mpt64基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)687 bp的特異性條帶，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1。

圖1 mpt64基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of mpt64 gene

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28ampt64的雙酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)687 bp的目的基因條帶，見(jiàn)圖2。測(cè)序證實(shí)，堿基序列與MtbH37Rv基因完全一致，表明mpt64基因片段已正確插入表達(dá)載體pET28a（+）中。

2.3 表達(dá)及純化產(chǎn)物的鑒定12%SDS-PAGE分析顯示，表達(dá)的重組MPT64蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約24 000，主要以包涵體形式存在，部分以可溶性形式存在；經(jīng)Ni2+-NTA親和柱純化后，純度可達(dá)90%，蛋白濃度約2.0mg／mL。見(jiàn)圖3。

2.4 重組MPT64蛋白的免疫原性及抗原特異性ELISA結(jié)果顯示，MPT64兔多克隆抗血清效價(jià)可高達(dá)1∶2 048 000，表明該重組蛋白具有良好的免疫原性。Western blot分析顯示，純化的MPT64蛋白可與兔多克隆抗血清反應(yīng)，在相對(duì)分子質(zhì)量約24 000處可見(jiàn)特異性條帶，見(jiàn)圖4，表明該重組蛋白具有良好的抗原特異性。

2.5 MPT64抗原檢測(cè)臨床血清的評(píng)價(jià)ELISA結(jié)果表明，TB組血清中的MPT64抗原特異性IgG、IgA抗體水平均顯著高于HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為5.272和2.130，P均<0.05）；而GroES和Ag85A抗原特異性IgG、IgA抗體水平兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tGroES分別為1.394和0.920 2，tAg85A分別為0.236 6和1.690；P均>0.05）。見(jiàn)圖5。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-mpt64的雙酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pET28ampt64（BamHⅠ／EcoRⅠ）

圖3 表達(dá)及純化的重組MPT64蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of expressed and purified recombinant MPT64

圖4 重組MPT64蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blotting of recombinant MPT64

圖5 ELISA法檢測(cè)受試者血清中的IgG和IgA抗體水平Fig.5 Determination of serum IgA and IgG levels in two groups by ELISA

3 討論

MPT64是Mtb生長(zhǎng)早期分泌的蛋白，由Rv1980c基因編碼，包含228個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約24 000。MPT64是一種僅由毒性分枝桿菌分泌的特殊蛋白，抗原特異性極強(qiáng)，能被CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞識(shí)別，并能刺激TB感染者機(jī)體產(chǎn)生IFNγ，對(duì)早期感染Mtb具有保護(hù)作用［9-10］，可作為T(mén)B的血清學(xué)診斷標(biāo)志物。GroES是Mtb分泌至體外的一種熱休克蛋白，是分枝桿菌體外培養(yǎng)時(shí)分泌最多的蛋白之一，可誘導(dǎo)較強(qiáng)的T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫［11-12］。Ag85A是Mtb和BCG培養(yǎng)濾液中分泌蛋白的主要組成部分，可誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和IFNγ產(chǎn)生［13］。

血清學(xué)檢測(cè)具有微創(chuàng)性、操作簡(jiǎn)易、適用于肺外結(jié)核和肺結(jié)核等優(yōu)點(diǎn)。CHEN等［14］進(jìn)行Rv2026c和Rv2421c多抗原的血清學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其Mtb檢測(cè)的敏感性和特異性分別為82.5%和88.12%。PUKAZHVANTHEN等［15］測(cè)定4種不同抗原的血清抗體水平，發(fā)現(xiàn)單個(gè)抗原檢測(cè)時(shí)敏感性為20%～52.5%，特異性95%，但聯(lián)合4種抗原檢測(cè)時(shí)，靈敏度升至75%，特異性降至88%。本文以GroES和Ag85A蛋白作為對(duì)照抗原，對(duì)重組MPT64蛋白在TB組和HC組血清中的IgG和IgA抗體水平進(jìn)行了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TB組血清中MPT64抗原特異性IgG和IgA水平均顯著高于HC組（P＜0.05），而兩組間GroES、Ag85A抗原特異性IgA和IgG水平差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)特異性固定為83%時(shí)，通過(guò)MPT64特異性IgG檢測(cè)可檢出55%的TB患者，而通過(guò)GroES或Ag85A特異性IgG檢測(cè)則僅可檢出41%或25%的TB患者。綜上所述，MPT64具有較好的TB檢出能力，可作為T(mén)B血清學(xué)診斷的備選抗原之一。如將MPT64與其他Mtb特異性抗原聯(lián)合使用進(jìn)行血清學(xué)診斷，有望進(jìn)一步提高TB早期診斷的靈敏度。