崔 黎，崔 瑩，趙 娜，陳奎生

(1．鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450052；2.鄭州衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院病理教研室，河南 鄭州 450199；3.鄭州市中心醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450007)

非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的80%[1]，在我國發(fā)病率近年來也是逐年攀升，且非小細(xì)胞肺癌中以肺腺癌最為多見[2]。目前，臨床上早期肺腺癌的治療仍是傳統(tǒng)的手術(shù)切除、放療、化療和近年來新興的靶向治療，而中晚期肺腺癌患者主要治療方法仍是化療。臨床治療實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用含鉑類藥物進(jìn)行化療是針對中晚期肺腺癌患者唯一支持療法，部分患者療效差，雖患者的總生存期有不同程度增加，但上限最多是20%反應(yīng)率和(或)中位生存期8～10個(gè)月[3]，腫瘤細(xì)胞生長快、強(qiáng)侵襲性和(或)出現(xiàn)耐藥是其主要原因。目前的靶向藥物都是針對肺腺癌K-RAS未突變的患者，尚無針對K-RAS突變肺腺癌的靶向治療藥物。DEAD盒多肽43(DEAD box polypeptide 43，DDX43)首次發(fā)現(xiàn)于人橫紋肌肉瘤LB23-SAR細(xì)胞株中，DDX43基因位于染色體6q12～13，由648個(gè)氨基酸構(gòu)成，全長2 300 bp，定位于細(xì)胞質(zhì)[4]。研究[5]揭示，在K-RAS信號通路的調(diào)節(jié)中DDX43基因起到重要作用，且高表達(dá)于多種實(shí)體腫瘤中。小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)作為一種重要的基因表達(dá)調(diào)控因子近年逐漸被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識，其可以選擇性剔除或關(guān)閉某個(gè)基因的表達(dá)[6-7]。其過程是指定目標(biāo)基因，利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將siRNA導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，從而敲弱目標(biāo)基因。因此，該技術(shù)可用于已知序列的基因標(biāo)定或沉默，是研究目標(biāo)藥物和(或)基因功能的重要方法和技術(shù)手段。研究[8]證實(shí)，DDX43基因在眾多實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞惡性增殖、腫瘤免疫和化療藥物耐藥有重要關(guān)系。本研究通過細(xì)胞免疫組化、原位雜交、MTT及TUNEL方法分別對各組人肺腺癌A549細(xì)胞進(jìn)行研究，探討DDX43 siRNA對司美替尼抑制A549細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡作用的影響，為肺腺癌患者尋找理想靶向藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株來源A549細(xì)胞株由河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑兔抗人DDX43多克隆抗體，購自河南天馳生物科技有限公司；司美替尼購自鄭州科邦生物科技有限公司；TUNEL試劑盒購自上海羅氏有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理對照組：A549細(xì)胞未做任何處理；司美替尼組：10 μmol/L司美替尼處理A549細(xì)胞12 h；司美替尼+DDX43 siRNA組：DDX43 siRNA載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24 h后，再用10 μmol/L司美替尼處理A549細(xì)胞12 h。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 轉(zhuǎn)染 1)常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，接種于六孔板，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；2)41 μL純化DDX43 siRNA溶入無血清、抗生素的400 μL培養(yǎng)基，獲得A液；3)制取B液：4 μL脂質(zhì)體加入400 μL無血清、抗生素的培養(yǎng)基；4)混勻A液、B液，室溫靜置30 min；5) 無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌A549細(xì)胞2遍，然后加入上一步驟的混合液，37 ℃培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)；6)分組收集培養(yǎng)的A549細(xì)胞，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.4.2 細(xì)胞免疫組化法檢測A549細(xì)胞中DDX43蛋白表達(dá) 按照說明書步驟進(jìn)行操作，滴加濃度為1100一抗(兔抗人DDX43多克隆抗體)50 μL，新鮮配制DAB液進(jìn)行顯色反應(yīng)，控制顯色時(shí)間，自來水中止顯色反應(yīng)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)替代一抗作為陰性對照，用已證實(shí)的DDX43蛋白陽性表達(dá)的食管癌組織切片作為陽性對照。DDX43蛋白陽性表達(dá)信號呈棕黃色細(xì)顆狀，定位于細(xì)胞質(zhì)中，采采用分析軟件定量分析其相對表達(dá)量。

1.4.3 原位雜交法檢測A549細(xì)胞中DDX43 mRNA表達(dá) 1)取出備用的A549細(xì)胞爬片，常溫放置l h后，PBS洗滌3次，每次5 min；2)浸泡細(xì)胞爬片于冰浴質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3% TtitonX-100溶液中，放置0.5 h，PBS洗滌3次，每次5 min；3)滴加體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫去離子水于備用細(xì)胞爬片上，室溫靜置0.5 h，再用滅菌蒸餾水洗滌細(xì)胞爬片3次，以到達(dá)滅活內(nèi)源性過氧化物酶的目的；4)暴露mRNA核酸片段：1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%檸檬酸混勻濃縮型2滴胃蛋白酶(注：現(xiàn)配現(xiàn)用)滴加在備用爬片上，室溫環(huán)境消化20 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滅菌蒸餾水洗滌1次；5)繼續(xù)滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%多聚甲醛，室溫下靜置10 min，用滅菌蒸餾水洗滌爬片3次；6)預(yù)雜交：密閉濕盒內(nèi)，滴加20 μL預(yù)雜交液于備用爬片上，42 ℃溫箱預(yù)雜交2～4 h；7)雜交：濕盒內(nèi)繼續(xù)滴加含有探針的雜交液20 μL，輕柔蓋上蠟?zāi)?，放置?2 ℃溫箱12～16 h；8)雜交后處理：在42 ℃條件下，0.1×檸檬酸鹽雜交液洗滌細(xì)胞爬片，洗脫非特異性雜交4次，每次15 min；9)雜交后顯色。RNase酶0.1 mg/mL降解實(shí)驗(yàn)爬片的mRNA后，用無探針雜交液孵育作為陰性對照，用已知的DDX43 mRNA陽性食管癌組織作陽性對照。DDX43 mRNA陽性定位于胞質(zhì)內(nèi)，呈現(xiàn)紫藍(lán)色顆粒，采用圖像分析軟件定量分析其相對表達(dá)量。

1.4.4 MTT比色法檢測A549細(xì)胞增殖情況 取A549細(xì)胞進(jìn)行分組處理；每孔中加入20 μL 5 μg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲亞砜150 μL，震蕩約10 min；酶標(biāo)儀測量各孔波長為492 nm，細(xì)胞生長抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對照組吸光度)×100%。

1.4.5 TUNEL法檢測A549細(xì)胞凋亡情況 按照試劑盒步驟操作，加入500 μL TUNEL反應(yīng)液，用現(xiàn)配的DAB溶液50 μL進(jìn)行顯色反應(yīng)，自來水中止顯色，并控制顯色時(shí)間。TUNEL計(jì)數(shù)凋亡的細(xì)胞核和凋亡小體，兩者均呈棕褐色，細(xì)胞核無著色為陰性細(xì)胞。計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)方法是隨機(jī)任選10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/200)×100%。

2 結(jié)果

2.1 各組DDX43蛋白相對表達(dá)量比較對照組、司美替尼組、司美替尼+DDX43 siRNA組DDX43蛋白相對表達(dá)量分別為138.20±17.72、79.95±8.96、36.16±6.31，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=66.72，P=0.02)；表達(dá)水平依次降低，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組DDX43蛋白相對表達(dá)量比較(×200)

2.2 各組DDX43 mRNA相對表達(dá)量比較對照組、司美替尼組、司美替尼+DDX43 siRNA組DDX43 mRNA相對表達(dá)量分別為266.20±15.07、164.95±8.96、71.16±6.31，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=125.35，P=0.01)；表達(dá)水平依次降低，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖2。

2.3 各組A549細(xì)胞凋亡指數(shù)比較對照組、司美替尼組、司美替尼+DDX43 siRNA組A549細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(3.75±0.55)%、(11.72±1.06)%、(19.98±1.21)%，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.37，P=0.04)；凋亡指數(shù)依次升高，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

圖2 各組DDX43 mRNA相對表達(dá)量比較(×200)

圖3 各組A549細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

2.4 各組A549細(xì)胞生長抑制率比較對照組、司美替尼組、司美替尼+DDX43 siRNA組A549細(xì)胞生長抑制率分別為(2.11±0.13)%、(14.91±0.29)%、(27.14±0.58)%，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.23，P=0.03)；生長抑制率依次升高，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

3 討論

DDX43在多種常見實(shí)體瘤中都有表達(dá)，但DDX43表達(dá)程度在不同實(shí)體瘤中有所差異，乳腺癌和膀胱癌組織中DDX43蛋白低表達(dá)，彌漫星形細(xì)胞瘤組織中中等強(qiáng)度表達(dá)，食管鱗癌、胃腺癌、惡性黑色素瘤、肝細(xì)胞癌及前列腺癌組織中均高表達(dá)[4,9-10]。研究[11]顯示，在多種淋巴造血腫瘤中DDX43 mRNA呈高表達(dá)。Abdel-Fatah等[12]通過對乳腺癌患者的追蹤研究發(fā)現(xiàn)，DDX43可作為預(yù)測患者對化療藥物反應(yīng)的指標(biāo)之一，也是乳腺癌患者不良預(yù)后因素參考指標(biāo)。多項(xiàng)研究[13-14]表明，DDX43下調(diào)可以促使該細(xì)胞群中的N-RAS蛋白表達(dá)下降，而其下游MEK和ERK信號通路的活性也顯著受抑。從而推測DDX43可以調(diào)控N-RAS蛋白表達(dá)，因此，可以通過上調(diào)RAS表達(dá)從而達(dá)到介導(dǎo)A549細(xì)胞對MEK抑制劑司美替尼的耐藥。

A549細(xì)胞中RAS低表達(dá)，在司美替尼耐藥細(xì)胞中DDX43高表達(dá)，增強(qiáng)RAS蛋白活性和表達(dá)、蛋白激酶B及ERK都會(huì)顯著升高。在A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染DDX43可以誘導(dǎo)RAS蛋白表達(dá)，進(jìn)而賦予細(xì)胞對司美替尼的耐藥表型，而利用DDX43 siRNA沉默DDX43同時(shí)也可以對司美替尼起到增敏作用。

本研究結(jié)果證實(shí)，DDX43 siRNA轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞中DDX43蛋白和mRNA的表達(dá)均呈下降趨勢，且DDX43 siRNA聯(lián)合司美替尼可抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，這為臨床治療肺腺癌和增強(qiáng)肺腺癌化療敏感性奠定理論基礎(chǔ)。