劉 晉，趙 軍

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，PMOP)屬高轉(zhuǎn)換型的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，是一種由于絕經(jīng)后婦女卵巢功能衰退、雌激素水平下降，繼發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn)、降鈣素分泌不足，從而導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，骨量逐漸減少，以單位體積骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)退變、破壞為特征，最終導(dǎo)致骨骼脆性增加而易于發(fā)生骨折的全身代謝障礙性骨病[1]。流行病學(xué)資料顯示中國大于60歲人群中的女性原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率為28.6%，并趨向于逐年升高[2]，因此，尋求有效預(yù)防和治療PMOP的方法有重要現(xiàn)實(shí)價(jià)值。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)用于治療PMOP的藥物較多，但各類藥物的有效性與安全性均存在爭議，如長期使用雌激素類藥物有導(dǎo)致乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及發(fā)生血栓的潛在危險(xiǎn)，其風(fēng)險(xiǎn)甚至超過受益；而長期補(bǔ)鈣易增加心血管事件風(fēng)險(xiǎn)[3]。所以在傳統(tǒng)民族醫(yī)藥中尋求療效可靠、毒副作用小的防治方法具有重要意義。但在眾多有關(guān)傳統(tǒng)民族醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究方向多為從骨代謝細(xì)胞因子、免疫組化學(xué)，甚至受體基因調(diào)控機(jī)制等角度探討其作用機(jī)理，而有關(guān)藥物對體質(zhì)量的影響，以及對子宮的安全性，尤其是和目前臨床常應(yīng)用的雌激素替代療法相比較，其研究報(bào)道相對較少。

本研究所用的民族藥藍(lán)刺頭(蒙醫(yī)名“烏日格斯圖呼和”)，菊科藍(lán)刺頭屬，漏蘆的干燥頭狀花序，載于蒙醫(yī)醫(yī)典《智慧文鑒》，有固骨質(zhì)、接骨愈傷之功效，用于治療筋傷骨折、金創(chuàng)、刺痛等癥[4]。

前期課題已對藍(lán)刺頭有效成分進(jìn)行了提取，證明了藍(lán)刺頭具有類雌激素樣作用，能夠有效防治PMOP。本次實(shí)驗(yàn)通過摘除大鼠卵巢的經(jīng)典方法復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，通過合理隨機(jī)對照分組、科學(xué)給藥、檢測體質(zhì)量時(shí)序性變化、子宮病理學(xué)計(jì)量指標(biāo)、骨密度(BMD)，并與陽性對照藥物進(jìn)行比較，旨在進(jìn)一步探究藍(lán)刺頭安全性，為傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源開發(fā)及利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品、試劑與儀器 藍(lán)刺頭制劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司提供。強(qiáng)骨膠囊：北京岐黃制藥有限公司，規(guī)格：0.25 g/粒，批號：20181103。己烯雌酚片：合肥久聯(lián)制藥有限公司，規(guī)格：0.5 mg/片，批號：20181004。 試劑：蘇木素-伊紅(HE)染液、5%堿性美藍(lán)溶液、亞甲基藍(lán)染液、乙醚、慶大霉素、酒精、碘酒、4% 甲醛溶液、二甲苯、氨水、PBS緩沖液、石蠟。儀器：3 000 r/min低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠出品；100倍Olympus SZX19型顯微鏡，日本奧林巴斯公司；圖像分析儀(清華同方Motic Image Advanced 3.0)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、冰箱、切片機(jī)，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；1/1 000電子稱，型號JA503，凱豐集團(tuán)有限公司；電子計(jì)重稱：ACS-H1型，上海?？惦娮觾x器廠。

其他器械：大鼠灌胃器、手術(shù)刀、動(dòng)物手術(shù)板、組織剪、斷頭器、尖頭和圓頭鑷、手術(shù)用圓針和三棱針、持針器、止血鉗、手術(shù)縫合線、無菌洞巾、醫(yī)用紗布、棉簽、10 mL注射器、研缽、玻璃棒、燒杯、移液槍槍頭、玻璃鐘罩、10 mL玻璃離心管、載玻片、數(shù)據(jù)紙、保鮮袋等相關(guān)實(shí)驗(yàn)器材。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

4月齡清潔級雌性Wistar大鼠84只，平均體質(zhì)量(250.00±20.00)g，購于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號：SCXK(蒙)2002-0001。

大鼠飼養(yǎng)條件一致：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)樓病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境清潔，恒溫、恒濕，室溫(25±2)℃，空氣濕度55%～65%，自然光照明，換氣風(fēng)扇通風(fēng)良好，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天；標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料喂養(yǎng)(由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，分籠飼養(yǎng)，自由攝食、水；飼養(yǎng)期間每7日稱1次體重，并每日記錄動(dòng)物飼養(yǎng)室的溫度變化。

1.3 動(dòng)物分組及建模

分組：隨機(jī)法依次分模型組、假手術(shù)組、藍(lán)刺頭高、中、低劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組共7組，每組12只，亞甲基藍(lán)染液分別編號。

建立PMOP大鼠模型：方法參照文獻(xiàn)[5]，用乙醚麻醉大鼠后，仰位固定，下腹備皮，鋪無菌洞巾，外科常規(guī)消毒，沿下腹部正中線2 cm切口打開腹腔，除假手術(shù)組(只切除卵巢周圍少量脂肪，不切卵巢)外，其余各組大鼠均完整摘除雙側(cè)卵巢，傷口內(nèi)滴入適量慶大霉素水溶液，止血后分層縫合。術(shù)后各組大鼠切口嚴(yán)格消毒。

術(shù)后恢復(fù)5天，逐只進(jìn)行陰道上皮細(xì)胞角化實(shí)驗(yàn)[6]，連續(xù)觀察5天，假手術(shù)組大鼠陰道涂片細(xì)胞主要由有核上皮細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞和白細(xì)胞組成(圖1A)，而模型組則以白細(xì)胞為主(圖1B)，提示造模成功。

圖1 光鏡下大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片

1.3 藥物干預(yù)和標(biāo)本采集

藥物干預(yù)：手術(shù)造模確認(rèn)成功后，各組大鼠分籠自由飼養(yǎng)90天后開始給予藥物干預(yù)。模型組和假手術(shù)組予相應(yīng)體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，藍(lán)刺頭高、中、低劑量組按生藥根據(jù)人鼠體表面積折算后，分別以13 mg/mL、6.5 mg/mL、3.25 mg/mL的劑量灌胃給藥，以低劑量組為臨床等效劑量；強(qiáng)骨膠囊組3.46 mg/mL、己烯雌酚組0.002 3 mg/mL，按成人有效劑量給藥。為便于配藥，以上藥物根據(jù)大鼠體重?fù)Q算為0.02 mL/g控制給藥量。每天灌胃1次，連續(xù)90天，至處死前24 h停止。

標(biāo)本采集：處死前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛0.8 mL腹腔注射麻醉，剖取雙側(cè)完整股骨，表面肌肉組織進(jìn)行剔除分離，保留骨膜，標(biāo)記右側(cè)股骨，生理鹽水浸泡過的紗布包裹，保鮮膜封存，恒溫冷藏保存，以備檢測骨密度(BMD)之用；摘取大鼠子宮，4 ℃室溫4%甲醛溶液固定24 h，以備HE染色。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 右側(cè)離體股骨骨密度測定 采用雙能DIREX-10骨密度儀對PMOP大鼠的右側(cè)離體股骨近段進(jìn)行檢測分析。顯微CT掃描大鼠右側(cè)股骨近心端，測量骨密度(BMD)、骨小梁體積/組織體積(BV/TV%)。

1.4.2 子宮不同部位病理學(xué)檢測 取出固定好的子宮組織，經(jīng)蒸餾水洗滌→酒精分梯度脫水→二甲苯透明→透蠟→石蠟包埋，改刀修整→切片機(jī)橫切面連續(xù)切片為4 μm厚度→水浴鍋展片→干凈載玻片貼片→62 ℃烤片3 h→二甲苯脫蠟10 min、梯度酒精、蒸餾水、PBS緩沖液逐級復(fù)水→蘇木精-伊紅(HE)染色→中性樹膠封片。

不同組PMOP大鼠各取5張切片(n0)，每張切片隨機(jī)再選擇5個(gè)視野(n1)，100倍倒置顯微鏡下對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度、子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞高度、腺腔內(nèi)徑、宮內(nèi)膜腺體面積百分比、肌全層(圖2、表1、表2)變化情況進(jìn)行觀察，拍照后采用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量時(shí)序性變化

表1 各組大鼠造模成型期體質(zhì)量變化

表2 各組大鼠灌胃治療期體質(zhì)量變化

表1顯示：模型組與假手術(shù)組相比較差異顯著(P<0.01)。表2顯示：模型組與假手術(shù)組相比較差異顯著(P<0.01)；藍(lán)刺頭高、中、低劑量組與假手術(shù)組相比較差別明顯(P<0.05)；強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組與模型組相比較區(qū)別顯著(P<0.05)；藍(lán)刺頭各劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、假手術(shù)組之間比較差異不明顯(P>0.05)。從整個(gè)實(shí)驗(yàn)的終末體質(zhì)量變化來看，大鼠去卵巢后的體質(zhì)量時(shí)序性變化均呈迅速增長，相比之下經(jīng)陽性藥物治療后的各去勢組大鼠體質(zhì)量增長速度減緩，具有顯著差異(P<0.01)，且藍(lán)刺頭劑量越大，大鼠體質(zhì)量越輕，呈線性關(guān)系。

2.2 骨組織計(jì)量學(xué)變化

表3結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，各組大鼠股骨頭近心端骨密度(BMD)、骨小梁體積/組織體積(BV/TV%)均下降(P<0.05)，其中模型組降低尤為明顯 (P<0.01)；藥物灌胃干預(yù)后，各給藥組與模型組比較，BMD、BV/TV%均顯著升高(P<0.05)；藍(lán)刺頭3劑量組之間比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與己烯雌酚組之間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 右側(cè)股骨干骺端骨組織計(jì)量學(xué)結(jié)果比較

2.3 子宮不同部位病理學(xué)變化

表4、表5結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組的子宮內(nèi)膜上皮高度、腺上皮高度、腺腔內(nèi)徑厚度、內(nèi)膜腺體面積均顯著降低 (P<0.01)。 與模型組比較，藍(lán)刺頭中劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組上述子宮組織各項(xiàng)指標(biāo)均明顯增加(P<0.05)，而三者之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2顯示，假手術(shù)組內(nèi)膜層較厚，內(nèi)膜腺腔明顯，全肌層較厚，細(xì)胞飽滿，排列致密。與其相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜層明顯萎縮，內(nèi)膜腺體面積減少，內(nèi)膜上皮及腺體上皮高度減??；子宮腺腔內(nèi)徑厚度變薄，子宮腺減少；全肌層顯著變薄，細(xì)胞縮小，排列松散。己烯雌酚組子宮內(nèi)膜層無顯著變薄，但上皮細(xì)胞水腫明顯，部分腺上皮細(xì)胞排列不規(guī)則，內(nèi)膜增生過快，尚未見病理惡變；藍(lán)刺頭組子宮內(nèi)膜層雖比正常對照組有不同程度萎縮，但依然較厚，且無細(xì)胞水腫現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 PMOP大鼠假手術(shù)組和模型組子宮不同部位病理切片比較

表4 術(shù)后25周子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞高度、子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞高度變化

表5 術(shù)后25周子宮腺腔內(nèi)徑厚度、子宮內(nèi)膜腺體面積百分比變化

3 討論

雌激素在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，女性絕經(jīng)或摘除卵巢后，雌激素水平下降、缺乏會(huì)加速骨轉(zhuǎn)換，促使骨形成和吸收偶聯(lián)失衡，從而發(fā)生骨質(zhì)疏松。而骨骼和子宮又是雌激素發(fā)揮作用的重要靶器官。骨密度(BMD)、骨小梁體積/組織體積(BV/TV%)是骨骼骨量和骨組織結(jié)構(gòu)的主要評價(jià)指標(biāo)，其中 BMD 為骨質(zhì)疏松癥的黃金診斷指標(biāo)[7]。子宮是女性重要生殖器官之一和生育場所，存在雌孕激素受體；也是內(nèi)分泌器官，可分泌前列腺素(PGE)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTH-RP)、腫瘤壞死因子(TNF)、胰島素樣生長因子(IGF)等多種激素和細(xì)胞因子。綜上，子宮對參與和調(diào)節(jié)機(jī)體骨代謝有重要意義。

有研究顯示，肥胖會(huì)增加身體負(fù)重[8]，易導(dǎo)致骨折發(fā)生；且肥胖人群體內(nèi)肌肉含量低，肌肉功能下降甚至受損，增加骨折風(fēng)險(xiǎn)。因此，控制體質(zhì)量有助于預(yù)防骨質(zhì)疏松。

在蒙醫(yī)經(jīng)典文獻(xiàn)[9]中，骨質(zhì)疏松屬“骨枯癥”范疇，其記載有“老年人赫依偏盛，體內(nèi)三根、七素平衡失調(diào)，精華分解、吸收與排泄功能紊亂，導(dǎo)致骨之精華吸收減少，易骨枯”。而刺頭是道地的野生傳統(tǒng)蒙藥材，在內(nèi)蒙古各地隨處可見，能夠壯骨、接骨。

本實(shí)驗(yàn)顯示在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)刺頭能夠明顯上調(diào)去卵巢大鼠BMD、BV/TV%表達(dá)水平，從而起到一定的骨保護(hù)作用，據(jù)前期研究成果[10]推測藍(lán)刺頭可能是通過上調(diào)骨組織雌激素受體(ER)的表達(dá)而發(fā)揮類雌激素樣作用；去勢會(huì)提高大鼠體質(zhì)量過快過高增長，會(huì)引發(fā)肥胖，藍(lán)刺頭能有效抑制體質(zhì)量迅速增長，有助于預(yù)防骨質(zhì)疏松，降低骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其可能也是通過經(jīng)典雌激素通路實(shí)現(xiàn)的；藍(lán)刺頭能夠提高子宮質(zhì)量/體質(zhì)量(UW/BW)、增加子宮內(nèi)膜厚度、防止子宮內(nèi)膜萎縮，延緩了子宮機(jī)能下滑狀態(tài)，從而在骨量維持方面發(fā)揮重要作用。并且與陽性對照藥物比較，藍(lán)刺頭組的子宮內(nèi)膜厚度增長速度不及己烯雌酚組，與強(qiáng)骨膠囊組相比則無明顯差異(P>0.05)，這一結(jié)果提示與西藥己烯雌酚相比，藍(lán)刺頭的雌激素樣副作用不明顯，其發(fā)生子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)性可能降低。因此，藍(lán)刺頭在防治PMOP的同時(shí)，可以有效避免雌激素替代療法給子宮帶來的嚴(yán)重不良影響。

綜上，藍(lán)刺頭可以對大鼠去卵巢后引發(fā)的骨量丟失、體質(zhì)量過快過高增長和子宮功能衰退起到一定防治作用，證實(shí)藍(lán)刺頭有效性、安全性較高，并具有簡(組方簡單、給藥量小)、效(有效成分清、效果一定)、驗(yàn)(理論、實(shí)驗(yàn)依據(jù)可靠)、廉(價(jià)低)優(yōu)勢，為應(yīng)用傳統(tǒng)民族醫(yī)藥理論防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。