何雨晴，陳迪路，張鄭潔，李翎熙，谷青青，周小江，張忠勤

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南振興中藥有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

大青葉是湖南省的一味特色中藥，為馬鞭草科植物路邊青ClerodendrumcyrtophyllumTurcz的干燥葉，又稱淡婆婆葉[1]。收載于《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2009版)，具有清熱解毒、涼血止血的功效，用于外感熱病熱盛煩渴、咽喉腫痛、口瘡、黃疸、熱毒痢、急性腸炎等癥[2]。路邊青常生長(zhǎng)在山地林邊、路旁及溪谷旁，主要分布于湖南省的安化、桃江、耒陽(yáng)、祁東、長(zhǎng)沙等地[3，4]。近年來，隨著大青葉市場(chǎng)需求量不斷增大，其野生資源逐漸枯竭，人工種植開始出現(xiàn)，其栽培方法為種子繁殖或分株法繁殖[5]。湘產(chǎn)大青葉含有黃酮類、二萜類、三萜類、甾醇類、糖苷類等成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用[6]，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)不完善。為了闡明湘產(chǎn)大青葉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者特采用UPLC-Q-TOF-MS法對(duì)湘產(chǎn)大青葉正丁醇提取物中的成分進(jìn)行分析，結(jié)合后續(xù)的藥效學(xué)研究結(jié)果，為闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS QTOF/MS、Masslynx V4.1工作站、UNIFI科學(xué)信息學(xué)系統(tǒng)(美國(guó) Waters 公司)；AS系列超聲波清洗機(jī)(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；CP214分析天平(奧豪斯儀器有限公司)；Sorvall ST 8R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)

1.2 材料與試劑

大青葉藥材于2018年7月采自新邵常春藤中藥材種植基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為馬鞭草科植物路邊青ClerodendrumcyrtophyllumTurcz的葉。

95%乙醇(分析純，上海泰坦化學(xué)有限公司)純凈水(華潤(rùn)怡寶飲料有限公司)；正丁醇(分析純，上海泰坦化學(xué)有限公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA公司；質(zhì)譜純，美國(guó) Fisher 公司)。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

湘產(chǎn)大青葉藥材0.5 kg，用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，用等體積的水飽和正丁醇萃取10次，減壓回收正丁醇并濃縮，真空干燥得正丁醇提取物。

取正丁醇提取物約0.01 g，精密稱定，加10 mL甲醇溶解，以15 000 r/min 離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜，即得。

2.2 檢測(cè)條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%的甲酸水，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～3 min，5%～10% B；3～6 min，10%～45% B；6～10 min，45%～55% B；10～15 min，55%～80% B，15～27 min，80%～100% B，27～30 min，100% B，30～31 min，5% B，31～35 min，5% B。流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)正負(fù)離子模式采集，離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；脫溶劑氣(N2)流速600 L/h；掃描范圍m/z100～1200；毛細(xì)管電壓2.5 kV；錐孔氣體流速50 L/h；錐孔電壓40 V；亮氨酸-腦啡肽[M-H]-=554.2620作為L(zhǎng)ockSpray校準(zhǔn)液(200 pg/mL)，流速10 μL/min，可產(chǎn)生碎片離子m/z556.2771[M+H]+。甲酸鈉溶液用來儀器校正。使用MassLynx V4.1和以中藥數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)的UNIFITM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與分析。

3 結(jié)果與分析

取湘產(chǎn)大青葉樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)行分析，獲得正、負(fù)離子模式全掃描總離子流，見圖1。由于正離子檢測(cè)模式下各成分的分離效果優(yōu)于負(fù)離子檢測(cè)模式，且響應(yīng)值高，故對(duì)正離子檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，首先通過相關(guān)文獻(xiàn)以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(Chemspider，SDBS，SCIfinder)的查詢，對(duì)已有化合物進(jìn)行總結(jié)，建立湘產(chǎn)大青葉UNIFI數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)合UNIFI軟件的自動(dòng)篩查功能，初步得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析結(jié)果，通過化合物裂解規(guī)律以及相關(guān)化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)軟件給出的可能存在的化合物列表進(jìn)行手動(dòng)鑒定，最終共鑒定出32個(gè)化合物。其中黃酮類及黃酮苷類成分9個(gè)，甾體類及萜類成分共7個(gè)，苯乙醇類成分3個(gè)及其他類成分13個(gè)，化合物保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子及碎片離子信息詳見表1。

圖1 兩種檢測(cè)模式下湘產(chǎn)大青葉的總離子流

3.1 化學(xué)成分的裂解特征分析

3.1.1 黃酮類成分鑒定 化合物2母核離子m/z359.1483[M+H]+，通過UNIFI擬合得到化合物分子式為C27H30O15，化合物名稱為5-羥基-3，6，7，4′-四甲氧基黃酮，其特征碎片為丟失一分子甲基形成的m/z344.1372[M-CH3]+及陸續(xù)丟失羰基、甲氧基、甲基形成的碎片m/z301.1067[M-2CH3-CO]+、255.1081[M-2CH3-2CO-H2O]+、194.0912[M-C10H10O2-2H]+，根據(jù)裂解規(guī)律及與文獻(xiàn)[7]對(duì)比，故推測(cè)其為5-羥基-3，6，7，4′-四甲氧基黃酮，5-羥基-3，6，7，4′-四甲氧基黃酮可能的裂解途徑見圖2。

化合物11母核離子m/z287.0534[M+H]+，其離子碎片為243.0467[M+H-CO]+、259.0283[M+2H-CO-OH]+、218.2107[M+3H-CO-C2H2O]+、163.0383[M+H-CO-C6H7O-H]+，結(jié)合文獻(xiàn)[8]與裂解規(guī)律進(jìn)行分析，推測(cè)為山奈酚。

化合物12母核離子m/z449.1064[M+H]+，其離子碎片為苷元碎片m/z287.0534[M+H-Glu]+、213.1949[M+H-Glu-2CO-H2O]+、163.0381[M+K-Glu-C9H6O3]+，根據(jù)UNIFI篩查結(jié)果推測(cè)為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷或槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷，結(jié)合文獻(xiàn)[9]與裂解規(guī)律，推測(cè)其為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物13母核離子m/z449.1024[M+H]+，其特征碎片為m/z457.2335[M+H+H2O]+，301.0693[M-Rha]+，經(jīng)軟件篩查與文獻(xiàn)[10]對(duì)比推測(cè)為槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物14母核離子m/z317.0638[M+H]+，其離子碎片為m/z302.0400[M+H-CH3]+、285.1289[M-CO-3H]+、274.0458[M+2H-CO2]+，通過比對(duì)文獻(xiàn)[11]，推測(cè)為胡麻素。

化合物15母核離子m/z463.1222[M+H+Na]+，其特征碎片為286.0454[M-Glu]+、258.0507[M-Glu-CO]+，通過比對(duì)文獻(xiàn)[12]，推測(cè)化合物為5，7-二羥基-3′-甲氧基黃酮-4′-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物16母核離子m/z301.0692[M+H]+，化合物19母核離子m/z271.0590[M+H]+，化合物26母核離子m/z314.8505[M]+，經(jīng)UNIFI篩查推測(cè)后與文獻(xiàn)[13-15]進(jìn)行比對(duì)，分別推測(cè)為金圣草素、芹菜醇以及cirsimartin。

表1 正離子模式下湘產(chǎn)大青葉提取物化學(xué)成分UPLC-Q-TOF/MS鑒定結(jié)果

3.1.2 甾體類及萜類成分鑒定 化合物4母核離子為m/z427.1261[M+H]+，其碎片離子為m/z411.1609[M-CH3]+、367.1018[M-2CH3-CO-H]+、272.2984[M+2H-C10H20O]+、252.0936[M+2H-C11H28O]+、205.0531[M+H-C15H26O]+，結(jié)合文獻(xiàn)[33]進(jìn)行分析，推測(cè)其為friedelin。

化合物9母核離子為m/z457.3683[M+H]+，其碎片離子為m/z475.3234[M+H+H2O]+、435.3309[M+H+Na-COOH]+、247.2159[M+H-C13H22O2]+、209.1635[M+H-C14H26O2]+，結(jié)合文獻(xiàn)[16]進(jìn)行分析，推測(cè)其為3-表齊墩果酸。

化合物30母核離子為m/z413.2626[M+H]+，其碎片離子為m/z414.2697[M+2H]+、279.0932[M+2H+H2O-C10H17O]+、301.1395[M-C8H15]+，經(jīng)比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)為clerosterol。

圖2 5-羥基-3，6，7，4′-四甲氧基黃酮可能的裂解途徑

化合物32母核離子為m/z413.3756[M+H]+，其碎片離子為m/z256.2613[M+H-C10H19-H2O]+、219.1724[M+3H-C13H24O]+、203.1410[M-C14H27O]+，結(jié)合文獻(xiàn)[34]與裂解規(guī)律，推測(cè)為豆甾醇。

化合物17母核離子為m/z301.0720[M+H]+，其碎片離子為m/z286.0466[M+H-CH3]+、258.0527[M+H-CH3-CO]+，通過比對(duì)文獻(xiàn)[17]，推測(cè)為Sugiol。

化合物18母核離子為m/z359.2306[M+H]+，其碎片離子為m/z340.7579[M-H2O]+、287.1479[M+2H-C4H9O]+、276.3673[M+3H-C4H5O2]+，結(jié)合文獻(xiàn)[18]與碎片離子裂解規(guī)律，推測(cè)其為cyrtophyllones A。

化合物31母核離子為m/z332.2691[M]+，其碎片離子為m/z301.1403[M-CH2OH]+、246.0363[M+H-C4H7O2]+、201.0448[M+H-C7H16O2]+、177.1238[M+H-C7H18O4]+，結(jié)合文獻(xiàn)[18]與碎片離子裂解規(guī)律，推測(cè)其為cyrtophyllones B。

3.1.3 苯乙醇類成分鑒定 化合物22母核離子為m/z625.1027[M+H]+，其離子碎片為645.4435[M+Na-2H]+、322.2474[M-Rha-C8H9O3-2H]+、163.0414[M-C8H9O3-Rha-Glu]+、137.0244[M-C9H7O3-Rha-Glu]+，經(jīng)碎片離子裂解規(guī)律與文獻(xiàn)[19]比對(duì)，推測(cè)其為acteoside。

化合物7與化合物8母核離子均為m/z647.1937[M+Na]+，經(jīng)UNIFI篩查，推測(cè)其為異類葉升麻苷或parvifloroside B，經(jīng)文獻(xiàn)[20-21]對(duì)比，既包含異類葉升麻苷的特征離子為m/z477.3296[M-Rha]+、 323.2496[M-Rha-C8H10O3]+、340.0072[M-Rha-C8H9O2]+，也包含parvifloroside B的m/z471.0188[M+H-aglycone]+、323.2496[M-aglycone-Rha-H]+、163.0387[M+H-aglycone-Rha-Glu]+，故推測(cè)保留時(shí)間tR為7.691 min，異類葉升麻苷或parvifloroside B同時(shí)出峰。

3.1.4 其他類成分鑒定 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)UNIFI篩查的結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)和在線數(shù)據(jù)庫(kù)搜索從湘產(chǎn)大青葉中共鑒定出了13個(gè)其他類成分，分別為馬鞭草苷、5-羥基馬鞭草苷、靛藍(lán)、adenosine、(+)-phillyrin、龍膽苦苷、色胺酮、異落葉松脂素、斯巴醇、芳姜黃烯、十六酸甲酯、Methyl (10S)-hydroxypheophorbide a、(10S)-Hydroxypheophytin a。

化合物3母核離子為m/z389.1425[M+H]+，其特征離子為m/z387.1620[M-H]+、227.1733[M-Glu+H]+，結(jié)合文獻(xiàn)[22]對(duì)比，推測(cè)為馬鞭草苷。

化合物5母核離子為406.2048[M+2H]+，其特征離子為m/z427.1275[M+Na]+、245.0974[M-Glu+3H]+，結(jié)合文獻(xiàn)[23]對(duì)比，推測(cè)為5-羥基馬鞭草苷。

化合物24碎片離子為m/z265.1749[M+3H]+、263.0792[M+H]+、247.3534[M-NH]+、235.4095[M+H-CO]+、219.1762[M+H-NH-CO]+，結(jié)合文獻(xiàn)[24]對(duì)比，推測(cè)為靛藍(lán)。

化合物27母核離子為m/z268.1029[M+H]+、136.0618[M+H-C5H8O4]+，結(jié)合文獻(xiàn)[25]對(duì)比，推測(cè)為adenosine。

化合物29母核離子為m/z535.3401[M+H]+，碎片離子為393.3018[M+Na-Glu]+、365.2579[M+2H+Na-Glu-OCH3]+，結(jié)合文獻(xiàn)[26]及碎片信息，推測(cè)為(+)-phillyrin。

化合物1母核離子為m/z357.1144[M+H]+，碎片離子為377.1475[M+Na-2H]+、355.0979[M-H]+、195.0725[M+2H-Glu]+，經(jīng)比對(duì)文獻(xiàn)[22]，推測(cè)為龍膽苦苷。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)首次采用UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合UNIFI篩查平臺(tái)對(duì)湘產(chǎn)大青葉正丁醇提取物化學(xué)成分進(jìn)行分析，再利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)(Chemspider，SDBS，SCIfinder)檢索與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)篩查出來的化合物進(jìn)行確認(rèn)，大大提高了鑒定化合物的效率。最終共鑒定出32個(gè)化合物，其中黃酮類成分9個(gè)，甾體類及萜類成分共7個(gè)，苯乙醇類成分3個(gè)，其他類成分13個(gè)。

實(shí)驗(yàn)過程中通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例及洗脫時(shí)間確定色譜條件，對(duì)正、負(fù)離子掃描模式進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，化合物分離度更好、信息更豐富，最終確定色譜條件和質(zhì)譜條件。實(shí)驗(yàn)過程中為了消除樣品浸膏中殘留的正丁醇，取少量浸膏用色譜純甲醇溶解，減壓干燥，重復(fù)3次。前期采用MTT法檢測(cè)湘產(chǎn)大青葉正丁醇提取物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，湘產(chǎn)大青葉正丁醇提取物濃度越大，細(xì)胞活性越低，表明有細(xì)胞毒性作用。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明湘產(chǎn)大青葉正丁醇提取物與LPS模型組比較沒有顯著性差異，不能排除細(xì)胞毒性作用，還需分離純化得到單體化合物后進(jìn)行抗炎活性部位篩選。

湘產(chǎn)大青葉收載于《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2009年版)，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀、鑒別、水分測(cè)定等內(nèi)容，缺含量測(cè)定項(xiàng)。本研究分析鑒定出了32個(gè)化合物，后續(xù)研究可對(duì)其中量大的化合物進(jìn)行分離純化，作為對(duì)照品，進(jìn)行含量測(cè)定和特征圖譜研究，從而為完善和提升湘產(chǎn)大青葉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。