劉乃榕，李景輝，任剛，李晶，詹杰

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種中樞神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床以進(jìn)行性記憶及認(rèn)知障礙，伴精神及行為異常為主要特征，目前病因迄今未明，尚無有效治療手段[1]，是影響全球公共健康的重大問題[2]。目前已知AD具有兩大病理特征，β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)沉積形成的細(xì)胞炎斑和tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)，典型的細(xì)胞炎斑核心是Aβ，Aβ沉積被認(rèn)為是AD始發(fā)因素。研究發(fā)現(xiàn)AD具有高度遺傳性，目前全基因組關(guān)聯(lián)研究已發(fā)現(xiàn)20多個AD風(fēng)險(xiǎn)基因。營養(yǎng)作為細(xì)胞分裂、增殖和代謝的物質(zhì)條件，伴隨著生命從孕育到終結(jié)的全過程。相對于遺傳學(xué)缺陷，表觀遺傳性疾病有可能通過生命早期的營養(yǎng)干預(yù)而發(fā)生逆轉(zhuǎn)，影響AD風(fēng)險(xiǎn)基因的表達(dá)。

研究顯示，成人體內(nèi)缺乏B12可引起血漿Hcy濃度升高，導(dǎo)致AD發(fā)生。本試驗(yàn)以維生素B12不同劑量對新生大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行早期干預(yù)，對比觀察維生素B12早期干預(yù)對DNA甲基化以及海馬神經(jīng)元成熟后對Aβ毒性作用的反應(yīng)，從細(xì)胞水平分析生命早期補(bǔ)充維生素B12對AD發(fā)病的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級SD大鼠20只(雌鼠15只，雄鼠5只)，體質(zhì)量300～350 g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供[許可證編號：SCXK(滬)2012-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 維生素B12(Sigma公司)；脫氧胞苷(deoxycytidine,dC)標(biāo)準(zhǔn)品、5-甲基脫氧胞苷(5-methyl-deoxycytidine，5-mdC)標(biāo)準(zhǔn)品；Aβ1-42、rat TFA(MCE)；AnnexinⅤ/PI凋亡試劑盒(達(dá)科為)；DNA提取試劑盒、蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法，天根)；四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)(Amresco公司)；丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)試劑盒(南京建成生物公司)。

1.3 主要儀器及設(shè)備 高效液相色譜儀(安捷倫8650)、酶標(biāo)儀(上海三科318C)；分光光度計(jì)(analytikjena公司SPECORD 210)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo HERAcell vios 160i)；熒光倒置顯微鏡(卡爾蔡司Axio Vert.Al)；全自動流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER CytoFLEX)；超聲細(xì)胞破碎儀(寧波新芝)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 新生大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞(hippocampal neuron cells,HNCs)培養(yǎng)[3-4]和分組 新生大鼠出生12 h內(nèi)取海馬組織，去除血管、筋膜等海馬無關(guān)組織，0.125%胰酶消化，吸管反復(fù)輕柔吹打至吹散細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化25 min，加入含血清的全培養(yǎng)液終止消化,200目尼龍篩過濾，1 000 r/min離心10 min去上清，含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)液吹散細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個/mL，接種于涂布10%賴氨酸的培養(yǎng)瓶中。每窩HNCs細(xì)胞隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、維生素B12低劑量組(200 μg/L)、中劑量組(400 μg/L)、高劑量組(600 μg/L)，添加干預(yù)因素后，置37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，換添加不同濃度維生素B12的無血清B27培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。此后每隔2～3天換液1次，每次無干預(yù)因素的空白B27培養(yǎng)液半量換液。培養(yǎng)期間，每天在倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長狀況。培養(yǎng)7 d左右，可見HNCs細(xì)胞形成突觸。

1.4.2 高效液相法測定 各組HNCs細(xì)胞DNA甲基化水平按DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，分光光度計(jì)法測定DNA濃度，DNA濃度滿足HPLC測定需求后，HPLC法測定基因組DNA甲基化水平[5-6]。色譜柱：Ultimate Polar-RP(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流動相：0.2%(體積分?jǐn)?shù))磷酸；流速：1.3 mL/min；檢測波長273 nm；進(jìn)樣量20 μL。分別配制5種濃度(1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L)的dC和5-mdC標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品色譜圖中2種脫氧核苷峰面積對應(yīng)的濃度(分別記為CdC和C5-mdC)，則樣品基因組DNA的整體甲基化水平(%)=100×C5-mdC/(C5-mdC+CdC)。

1.4.3 Aβ1-42熟化及細(xì)胞損傷模型的建立[7]Aβ1-42用無菌磷酸鹽緩沖液配制成2×103μmol/L的Aβ原液，37 ℃孵育5 d成纖維狀，-20 ℃保存?zhèn)溆?。各組HNCs細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞元細(xì)胞形成突觸。模型組及各劑量干預(yù)組換成含5 μmol/L熟化Aβ的B27培養(yǎng)液造模，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長狀況。

1.4.4 MTT比色分析法 計(jì)算細(xì)胞增殖率新生大鼠HNCs 96孔板培養(yǎng)，分組、維生素B12添加及Aβ染毒造模方法同前，MTT比色分析，酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對照組×100%。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 各組HNCs細(xì)胞胰酶消化，F(xiàn)ITC-AnnexinV/PI雙熒光標(biāo)記，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。FlowJo軟件分析結(jié)果，結(jié)果以凋亡細(xì)胞的百分率表示。細(xì)胞凋亡率=晚期細(xì)胞凋亡率+早期細(xì)胞凋亡率。

1.4.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)測定 收集各組HNCs培養(yǎng)液，按試劑盒使用說明操作，用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量，比色法測定GSH-PX活力。

各組HNCs細(xì)胞胰酶消化，冰水浴條件下超聲細(xì)胞破碎，功率300 W，每次超聲3～5 s，間隔30 s，重復(fù)4～5次，黃嘌呤氧化酶法按試劑盒使用說明測定SOD活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件包對各組變量值做方差分析和組間差異顯著性分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維生素B12早期干預(yù)對新生大鼠HNCs細(xì)胞DNA甲基化的影響及不同處理比較 見表1。

表1 維生素B12早期干預(yù)對HNCs細(xì)胞DNA甲基化的影響

由表1結(jié)果可知,新生大鼠HNCs細(xì)胞出生12 h內(nèi)進(jìn)行維生素B12低、中、高劑量干預(yù)后DNA甲基化水平較空白組均有降低，其中低、中劑量組低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 維生素B12早期干預(yù)對Aβ染毒HNCs細(xì)胞增殖率的影響 見表2。

表2 維生素B12早期干預(yù)對HNCs細(xì)胞增殖率的影響

圖2結(jié)果顯示，Aβ染毒24 h后，模型組與空白組比較細(xì)胞增殖率顯著下降(P<0.01)，與模型組對比觀察可知，維生素B12早期干預(yù)組HNCs細(xì)胞Aβ染毒24 h后，各組細(xì)胞增殖率水平與模型組比較均有提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 維生素B12早期干預(yù)對Aβ染毒HNCs細(xì)胞凋亡的影響 見圖1。

注：Q1：壞死細(xì)胞；Q2：晚期凋亡細(xì)胞；Q3：早期凋亡細(xì)胞；Q4：活細(xì)胞

圖1結(jié)果顯示，Aβ染毒24 h后，模型組細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯增多，細(xì)胞凋亡率明顯高于空白組(72.7%vs38.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

維生素B12干預(yù)各組與模型組比較細(xì)胞凋亡率均有降低，分別為60.4%、51.3%、52.9%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 維生素B12早期干預(yù)對Aβ染毒HNCs細(xì)胞抗氧化能力的影響 見表3。

表3 維生素B12早期干預(yù)對Aβ染毒HNCs細(xì)胞抗氧化能力的影響

表3結(jié)果顯示，Aβ染毒24 h后，模型組HNCs的丙二醛較空白組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，維生素B12干預(yù)各組均可顯著減少Aβ染毒后HNCs的丙二醛含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Aβ染毒24 h后，模型組SOD活性明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維生素B12干預(yù)各組Aβ染毒后HNCs的SOD活力較模型組均有提高,其中低劑量組與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Aβ染毒24 h后，模型組GSH-Px活性明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維生素B12干預(yù)各組Aβ染毒后HNCs的GSH-Px活性較模型組均有提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

AD是老年人認(rèn)知障礙癥最主要的類型之一，是一個全球性的健康問題，給社會和家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)。該病至今病因和發(fā)病機(jī)制未明，尚無公認(rèn)有效的治療方法，目前已知AD具有兩大病理特征，Aβ沉積形成的細(xì)胞炎斑和tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)[7]。Aβ學(xué)說認(rèn)為AD的發(fā)病機(jī)制是多種基因變異，導(dǎo)致Aβ淀粉樣沉淀，形成神經(jīng)炎斑，逐漸損傷突觸及神經(jīng)細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子增高，腦內(nèi)蛋白酪氨酸激酶活化，tau蛋白過度磷酸化，與神經(jīng)細(xì)胞微管蛋白纏結(jié)；Aβ同時損傷線粒體膜，影響神經(jīng)細(xì)胞能量代謝和乙酰膽堿的合成與釋放，導(dǎo)致神經(jīng)興奮傳遞減慢，神經(jīng)細(xì)胞功能喪失，臨床出現(xiàn)記憶障礙，甚至癡呆癥狀。Aβ1-42是人體內(nèi)最常見的Aβ亞型之一，具有更強(qiáng)的毒性，且更容易聚集，形成Aβ沉淀的核心，引發(fā)神經(jīng)毒性作用。研究結(jié)果顯示，成熟的HNCs體外培養(yǎng)加入5 μmol/L的Aβ1-42染毒24 h可造成HNCs細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率升高，丙二醛含量增高，SOD活性和GSH-PX活性下降，證明Aβ1-42導(dǎo)致HNCs的自由基損傷增加，同時誘導(dǎo)HNCs發(fā)生細(xì)胞凋亡，加速HNCs退行性損傷。

充足的營養(yǎng)對正常的大腦結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，尤其是妊娠期及嬰幼兒時期的營養(yǎng)為大腦的形成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，甚至影響整個生命周期的認(rèn)知、運(yùn)動、語言和情緒等大腦功能[8-9]。維生素B12(鈷胺素)主要參與一碳單位循環(huán)，在機(jī)體同型半胱氨酸合成蛋氨酸的轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)過程中扮演著重要角色?，F(xiàn)代研究顯示，該藥物能夠有效促進(jìn)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元髓鞘及卵磷脂的形成，從而對軸突再生、促進(jìn)神經(jīng)生長產(chǎn)生較強(qiáng)的刺激。此外，該藥物分子還能夠轉(zhuǎn)移到神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞器中，增加神經(jīng)遞質(zhì)的代謝活性，從而改善神經(jīng)組織代謝障礙及傳遞作用。成人體內(nèi)缺乏B12可引起血漿Hcy濃度升高，導(dǎo)致AD發(fā)生，通過科學(xué)補(bǔ)充可抑制腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抑制自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低腦神經(jīng)損害[10-11]。

本研究結(jié)果顯示，維生素B12作用于出生12 h內(nèi)的大鼠海馬神經(jīng)元，可降低神經(jīng)元細(xì)胞的甲基化水平，發(fā)揮表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)作用，其影響可一直持續(xù)，并在成熟期HNCs對抗Aβ神經(jīng)毒性作用中繼續(xù)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，參與神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾和損害，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減緩神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而可能在預(yù)防AD方面發(fā)揮有益效應(yīng)。維生素B12安全性研究中人群資料顯示人體攝入維生素B12后的毒性很低，目前尚無維生素B12毒性反應(yīng)及生殖與發(fā)育毒性的報(bào)道，也為其在生命早期干預(yù)達(dá)到AD預(yù)防作用提供了可能。