馬居奎，張成玲，楊冬靜，謝逸萍，孫厚俊

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221131)

【研究意義】甘薯腐爛莖線蟲(DitylenchusdestructorThorne)又稱馬鈴薯腐爛莖線蟲，是一種寄生于重要經(jīng)濟(jì)作物的遷移性內(nèi)寄生線蟲，可寄生超過(guò)120種植物[1-2]。甘薯腐爛莖線蟲最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)的儲(chǔ)藏甘薯中[3]，主要發(fā)生在溫帶及亞熱帶地區(qū)，現(xiàn)有報(bào)道的發(fā)生區(qū)域包括亞洲、非洲、北美洲、南美洲、大洋洲和歐洲[4]。為控制其傳播擴(kuò)散，該線蟲已被亞太植物保護(hù)組織及許多國(guó)家和地區(qū)列為植物檢疫性有害生物。甘薯腐爛莖線蟲在國(guó)外主要為害馬鈴薯，平均每年給美國(guó)馬鈴薯產(chǎn)量的損失達(dá)10 %以上[5]。在我國(guó)，主要為害甘薯，是我國(guó)北方薯區(qū)甘薯生產(chǎn)的三大病害(莖線蟲病、黑斑病、根腐病)的病原之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自1937年首次報(bào)道以來(lái)，甘薯腐爛莖線蟲病已成為北方薯區(qū)最嚴(yán)重的的病害。主要為害甘薯地下莖及塊根，嚴(yán)重時(shí)可擴(kuò)展至地上莖部，一般可引起甘薯產(chǎn)量減產(chǎn)30 %～50 %，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)到80 %以上，甚至絕收[6]。近年來(lái)，該線蟲在我國(guó)河北、甘肅、內(nèi)蒙古和黑龍江地區(qū)為害馬鈴薯的現(xiàn)象被陸續(xù)報(bào)道[7]。此外，陳品三(1988)和王玉娟(1990)等先后報(bào)道了甘薯腐爛莖線蟲可引起當(dāng)歸麻口病[8-9]。由于我國(guó)在過(guò)去很長(zhǎng)一段時(shí)間里未對(duì)該線蟲病害進(jìn)行系統(tǒng)的調(diào)查和準(zhǔn)確鑒定，導(dǎo)致甘薯腐爛莖線蟲通過(guò)甘薯種薯運(yùn)輸、種苗調(diào)運(yùn)、農(nóng)事操作以及花卉植物的種苗、苗木運(yùn)輸?shù)韧緩?，已擴(kuò)散到我國(guó)十多個(gè)省。目前，腐爛莖線蟲的種類鑒定主要通過(guò)利用雌成蟲的形態(tài)學(xué)特征，但當(dāng)只有幼蟲、卵和雄蟲時(shí)，形態(tài)學(xué)就不能識(shí)別。此外，該線蟲存在明顯的種內(nèi)分化現(xiàn)象，不同群體在致病性、基因型和形態(tài)學(xué)方面都存在明顯的差異[10]。由于形態(tài)學(xué)鑒定方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜需要較強(qiáng)的專業(yè)技能，因此基于DNA的分子檢測(cè)技術(shù)逐漸成為線蟲檢測(cè)最常用的手段，主要包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)、特異引物PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等[11-16]。PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)具備準(zhǔn)確、高效、靈敏度高的特點(diǎn)，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)對(duì)根際線蟲的定量檢測(cè)；但以PCR為基礎(chǔ)的分子檢測(cè)需要相對(duì)高質(zhì)量的DNA模板，擴(kuò)增和檢測(cè)需要PCR儀等，且檢測(cè)過(guò)程需要數(shù)小時(shí)，存在對(duì)儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)條件、人員專業(yè)素質(zhì)要求較高的缺點(diǎn)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)越來(lái)越受到關(guān)注。該技術(shù)在恒溫條件下進(jìn)行且反應(yīng)更加迅速，不需要昂貴熱循環(huán)儀等儀器設(shè)備[17]。重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一種由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶參與的恒溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)，可在37～42 ℃下連續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間只需15～30 min。該技術(shù)已應(yīng)用于南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲等根際線蟲的分子診斷[18-20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文以甘薯腐爛莖線蟲ITS序列設(shè)計(jì)特異性RPA引物，采用不同甘薯腐爛莖線蟲地理群體進(jìn)行驗(yàn)證，建立甘薯腐爛莖線蟲RPA反應(yīng)體系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究結(jié)果為快速檢測(cè)甘薯腐爛莖線蟲提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試線蟲 供試線蟲群體名稱、寄主及地理來(lái)源見表1。

1.1.2 主要試劑動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒、瓊脂糖購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司；RPA核酸擴(kuò)增試劑盒(TwistAmp?Basic Kit)購(gòu)于南京紐帕斯生物科技有限公司；EmeraldAmp?MAX PCR Master Mix、DL2000 DNA maker及蛋白酶K購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；Omega HP Plant DNA Kit試劑盒、PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒購(gòu)于鼎思(南京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 線蟲種群和DNA提取 從全國(guó)不同地區(qū)采集病薯，采用淺盤法分離獲得甘薯腐爛莖線蟲(表1)。收集甘薯腐爛莖線蟲放入1.5 mL離心管中，經(jīng)5000 r/min離心10 min后，使用移液器盡量吸去管中的水，將離心管放入液氮中速凍30 s后，使用研磨杵進(jìn)行研磨，研磨后的勻漿使用動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工)提取線蟲DNA。南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲、大豆胞囊線蟲、禾谷胞囊線蟲、貝西滑刃線蟲、咖啡短體線蟲等群體采用同樣試劑盒提取DNA模板備用。所有供試群體均通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子鑒定確認(rèn)。

表1 供試線蟲群體信息

表2 本文所用的引物及其序列信息

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和檢測(cè) 根據(jù)結(jié)果，從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載甘薯腐爛莖線蟲核糖體ITS序列(GenBank No：EF210372)及其他植物寄生線蟲ITS基因序列，進(jìn)行多重比對(duì)分析，尋找序列中的特異性片段，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行合成。

RPA反應(yīng)使用TwistAmp?Basic Kit，反應(yīng)總體系為50 μl，首先在0.2 mL的PCR管中加入緩沖液29.5 μl，10 μmol/L的上游引物DD-RPAF和下游引物DD-RPAR(表2)各2.4 μl，DNA模板1 μl(～10 ng)，ddH2O 12.2 μl，用移液器吸打混勻后，加入到含有RPA凍干酶粉的反應(yīng)管中，并用移液器混勻，最后加入280 mmol/L的MgAc溶液2.5 μl。將上述RPA擴(kuò)增體系充分混勻，置于39 ℃的水浴或者金屬浴孵育25 min，獲得RPA擴(kuò)增產(chǎn)物。將5 μl RPA產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像。

1.2.3 甘薯腐爛莖線蟲RPA反應(yīng)靈敏度檢測(cè) 提取甘薯腐爛莖線蟲的基因組DNA，采用Nanodrop2000 測(cè)定DNA濃度，再用水將其稀釋成10、1、10-1、10-2、10-3ng/μl。

分別以這5種不同濃度的甘薯腐爛莖線蟲DNA為模板(1 μl)，以清水為陰性對(duì)照，參照1.2.2進(jìn)行RPA反應(yīng)并檢測(cè)。

普通PCR以上述梯度稀釋的DNA模板，擴(kuò)增體系為25 μl，DNA模板1 μl，10 μM引物DdF1和DdR1(表2)各1 μl，EmeraldAmp?MAX PCR Master Mix(TaKaRa，大連)12.5 μl，ddH2O補(bǔ)足至25 μl，以清水為陰性對(duì)照，在Eppendorf PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 4 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。將5 μl PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.2.4 單條甘薯腐爛莖線蟲RPA反應(yīng)靈敏度檢測(cè) 挑取單條甘薯腐爛莖線蟲，置于含有10 μl裂解緩沖液(8 μl ddH2O和1 μl 10×PCR buffer)的200 μl PCR管中，隨后在液氮中冷凍2 min，65 ℃水浴2 min，重復(fù)3次，然后向PCR管中加入1 μl 10 mg/mL蛋白酶K，65 ℃溫育1.5 h，95 ℃處理10 min，14 000 r/min離心1 min，獲得單條甘薯腐爛莖線蟲DNA模板(以100計(jì))，并按10倍梯度依次稀釋10-1、10-2、10-3和10-4條線蟲DNA。以上述梯度的DNA模板進(jìn)行RPA和PCR反應(yīng)檢測(cè)。

1.2.5 混合樣本RPA反應(yīng)檢測(cè) 將20條甘薯腐爛莖線蟲和50 mg甘薯薯塊組織混合作為檢測(cè)對(duì)象，陰性對(duì)照為不含甘薯腐爛莖線蟲的甘薯薯塊組織。甘薯腐爛莖線蟲和植物組織(甘薯薯塊組織)混合樣本DNA提取采用Omega HP Plant DNA Kit試劑盒。

將100條腐爛莖線蟲和250 mg自然狀態(tài)下土壤混合作為檢測(cè)樣本，陰性對(duì)照為不含甘薯腐爛莖線蟲的土壤。腐爛莖線蟲和土壤混合樣品的DNA提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒。

1.2.6 田間病樣檢測(cè) 采集6個(gè)罹病甘薯薯塊樣本和4個(gè)罹病薯塊周圍土壤，分別采用Omega HP Plant DNA Kit試劑盒和PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取DNA備用。采用RPA法和普通PCR法對(duì)DNA樣本進(jìn)行測(cè)定，以未發(fā)病薯塊DNA樣本和土壤作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA引物特異性檢測(cè)

將5 μl RPA產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)DNA染料染色后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像；引物DD-RPAF、DD-RPAR擴(kuò)增后，甘薯腐爛莖線蟲群體能穩(wěn)定獲得230 bp特異性片段，而南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲、大豆孢囊線蟲、禾谷孢囊線蟲、貝西滑刃線蟲、咖啡短體線蟲等群體無(wú)特異性條帶(圖1)，表明該引物可特異性擴(kuò)增甘薯腐爛莖線蟲樣本。

2.2 甘薯腐爛莖線蟲群體基因組DNA 的RPA反應(yīng)靈敏度檢測(cè)

提取甘薯腐爛莖線蟲基因組DNA，采取10倍梯度稀釋，通過(guò)RPA和PCR 2種方法檢測(cè)其靈敏度。當(dāng)樣本最大稀釋至10-2ng/μl時(shí)，2種方法能夠分別擴(kuò)增產(chǎn)生約230和495 bp的特異性條帶，樣本進(jìn)一步稀釋均無(wú)擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，表明 RPA技術(shù)與普通PCR檢測(cè)的靈敏度相當(dāng)，檢測(cè)限約為10-2ng/μl(圖2)。

2.3 單條甘薯腐爛莖線蟲RPA反應(yīng)靈敏度檢測(cè)

提取單條甘薯腐爛莖線蟲基因組DNA，采取10倍梯度稀釋，通過(guò)RPA和PCR 2種方法檢測(cè)其靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，樣本最大稀釋至100倍時(shí)，2種方法能夠分別擴(kuò)增產(chǎn)生約230 和495 bp的特異性條帶，樣本進(jìn)一步稀釋均無(wú)擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，表明RPA技術(shù)與普通PCR檢測(cè)的靈敏度相當(dāng)，檢測(cè)限約為1/100條線蟲(圖3)。

2.4 混合樣本RPA反應(yīng)檢測(cè)

對(duì)甘薯腐爛莖線蟲—薯塊組織和線蟲—土壤混合樣本分別進(jìn)行RPA反應(yīng)檢測(cè)，結(jié)果顯示，存在甘薯腐爛莖線蟲的混合樣本都能產(chǎn)生特異性條帶，而在僅有薯塊組織和土壤的樣本中無(wú)特異性條帶產(chǎn)生(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，RPA技術(shù)可用于甘薯腐爛莖線蟲的田間檢測(cè)。

2.5 田間病樣檢測(cè)結(jié)果

田間檢測(cè)結(jié)果顯示，RPA檢測(cè)法和PCR檢測(cè)法基本一致，6個(gè)病薯中均檢測(cè)到甘薯腐爛莖線蟲。但在病薯根際土壤中部分樣本，RPA和PCR檢測(cè)法均未檢測(cè)到該線蟲(表3)。這可能是由于土壤中線蟲數(shù)量較少，提取模板濃度較低導(dǎo)致的。

3 討 論

重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技術(shù)是一種新興的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，在病害診斷過(guò)程中越來(lái)越受到關(guān)注[21]。本文建立了甘薯腐爛莖線蟲RPA檢測(cè)方法，使用特異性的RPA引物(DD-RPAF/DD-RPAR)在39 ℃的恒溫條件下，25 min即可完成DNA快速擴(kuò)增。前人的研究表明，在37～42 ℃恒溫條件下，RPA反應(yīng)在60 min內(nèi)可以產(chǎn)生10億個(gè)DNA拷貝[22]，相比于普通PCR反應(yīng)(2.5 h)和LAMP反應(yīng)(1 h)，反應(yīng)時(shí)間更短[23]。此外，RPA技術(shù)低溫孵育取代了PCR的熱循環(huán)模式，使該技術(shù)有望成為田間檢測(cè)甘薯腐爛莖線蟲一種行之有效的方法。

RPA技術(shù)的關(guān)鍵是篩選出特異性高的引物[24]，引物設(shè)計(jì)規(guī)則與PCR相似，但引物略長(zhǎng)于PCR引物，引物堿基數(shù)介于30～38 bp之間時(shí)可以提高引物與重組酶結(jié)合的穩(wěn)定性，更好地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)[25-26]。在靈敏度檢驗(yàn)中，一些研究發(fā)現(xiàn)RPA技術(shù)與PCR或real-time PCR反應(yīng)相接近[27-28]。此外，某些RPA反應(yīng)靈敏度被證實(shí)高于普通PCR反應(yīng)[20,29]。本研究中，甘薯腐爛莖線蟲RPA反應(yīng)與PCR反應(yīng)靈敏度一致，基因組DNA檢出限約為10-2ng/μl，單條甘薯腐爛莖線蟲檢出限約為1/100條線蟲。因此，該RPA引物可用于甘薯腐爛莖線蟲的分子鑒定和病害診斷。為保證該方法檢測(cè)可靠性和穩(wěn)定性，本研究中利用設(shè)計(jì)的RPA引物對(duì)8個(gè)甘薯腐爛莖線蟲群體和7種形態(tài)、生物學(xué)特性相似的植物寄生線蟲進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該RPA方法具有良好的特異性和穩(wěn)定性。

在自然條件下，甘薯腐爛莖線蟲往往寄生于植物組織或者土壤中，許多自然條件下樣本中都含有目標(biāo)以外的各種雜質(zhì)，特別是土壤中，含有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的微生物和有機(jī)肥料等物質(zhì)[30]。土壤中的多種微生物與環(huán)境的相互作用，DNA提取過(guò)程中一些腐殖質(zhì)及土壤中許多未知因素都可能嚴(yán)重影響對(duì)目標(biāo)線蟲的檢測(cè)。本研究建立的RPA方法不僅可以從群體gDNA和單條線蟲DNA檢測(cè)到甘薯腐爛莖線蟲，而且還可以從病薯組織或病薯根際土壤中檢測(cè)到甘薯腐爛莖線蟲，省去了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和PCR檢測(cè)方法所需的從樣本中分離目標(biāo)線蟲的步驟，簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。

表3 樣品檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPA技術(shù)是一種耗時(shí)短、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的甘薯腐爛莖線蟲分子鑒定技術(shù)。本研究建立的RPA檢測(cè)方法可用于甘薯腐爛莖線蟲檢測(cè)診斷，對(duì)甘薯莖線蟲病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、早期診斷和指導(dǎo)科學(xué)施藥具有重要意義。