張嵐，賀武斌，孔亞男，鐘倩，于歡

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；2.錦州醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

腦出血是嚴(yán)重的腦卒中疾病，患者死亡率高、預(yù)后差。臨床治療腦出血一般采取調(diào)脂、降壓、降糖、補充腦營養(yǎng)等保守治療方法，但療效和預(yù)后的改觀均不明顯[1-2]。腦水腫是腦出血患者的常見合并癥之一，也是引發(fā)神經(jīng)功能缺損、促使腦出血加重的首要因素，水通道蛋白4(AQP-4)參與腦組織細(xì)胞的水分子轉(zhuǎn)膜，與腦水腫的發(fā)生密切先關(guān)，在腦出血發(fā)生后，AQP-4的表達(dá)水平顯著增加，用以清除胞間多余水分、維持腦細(xì)胞水平衡[3-4]。阿托伐他汀是一種常用的羥甲基戊二酸單酰輔酶還原酶抑制劑，具有調(diào)脂、抗炎、修復(fù)血管內(nèi)皮和促進(jìn)腦神經(jīng)新生的作用，還有研究提示阿托伐他汀能夠下調(diào)APQ-4并因此起到抗腦水腫的治療效果，為了探討阿托伐他汀對于腦出血的療效、神經(jīng)功能、腦組織形態(tài)學(xué)和腦水量的影響，進(jìn)一步分析阿托伐他汀與APQ-4表達(dá)的關(guān)系和作用機制，特進(jìn)行本次動物實驗。

1 資料和方法

1.1 實驗對象

選取SD大鼠共120只，雌雄各60只，由中科院動物研究所提供，體重250～300 g，在我院動物實驗中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)用飼料購自由上海帆泊生物，SD大鼠飲用水為自來水，溫度(20～25)℃，每天光照時間為12 h，飼養(yǎng)室濕度40%～80%，每日清潔飼養(yǎng)籠、更換墊料，飼養(yǎng)1 w，待大鼠適應(yīng)環(huán)境后，剔除生病、死亡大鼠并進(jìn)行相關(guān)動物實驗。

向大鼠腹腔注射麻醉藥物，向顱內(nèi)注射自體血構(gòu)建腦出血SD大鼠模型，從存活大鼠中以腦出血動物行為學(xué)分級結(jié)果選擇腦出血分級1～3級SD大鼠，根據(jù)性別分層隨機抽樣選擇80只SD大鼠(雌雄各半)作為造模成功的最終實驗對象。將80只SD大鼠隨機分為治療組和對照組，每組40只，治療組給予10 mg/kg阿托伐他汀進(jìn)行灌胃治療，對照組注射等量無菌生理鹽水，兩組以給藥前24 h、給藥后96 h作為觀察點分配SD大鼠，見表1。

表1 兩組不同觀察點的SD大鼠分配情況統(tǒng)計(只)

1.2 試劑和儀器

試劑：3.5%水合氯醛(武漢博萊特化工)、阿托伐他汀鈣片(國藥準(zhǔn)字：H20051407；生產(chǎn)廠家：輝瑞制藥有限公司；規(guī)格：10 mg×7 s)、AQP-4 Elisa檢測試劑盒(臻科生物)、蘇木精伊紅染色液(廣州藝得諾生物科技有限公司)；PBS溶液、二甲苯、0.9%生理鹽水、梯度酒精、3%H2O2、甲醛溶液均在我院病理科配制。

儀器：2CA-320M數(shù)字?jǐn)z像生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)、BS210S電子天平(德國賽多利斯)、微量溶液進(jìn)樣器(北京英偉達(dá)科技有限公司)、恒溫干燥箱(上海精若科學(xué)儀器有限公司)、鼠腦立體定位儀(西南醫(yī)科大學(xué)中心實驗室)、Image-Pro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)、相關(guān)手術(shù)器械由我院提供。

1.3 方法

1.3.1 腦出血SD大鼠造模手術(shù) 本研究采用自體血顱內(nèi)注入術(shù)制作腦出血SD大鼠模型，用于造模的120只大鼠在術(shù)前均禁飲食8 h以上，稱重后向大鼠腹腔注射0.01 mL/g劑量的3.5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，麻醉完全后，取仰臥位，大鼠頭顱置于鼠腦立體定位儀，固定大鼠牙齒、耳道，使其前囟、后囟保持正中水平。剃顱頂毛，消毒鋪巾，在兩耳連線正中行2 cm垂直切口，完全暴露顱骨，加30%雙氧水腐蝕筋膜后，在前囟前0.2 mm、前囟、后囟連線中線后3 mm以牙鉆垂直小心地鉆1 mm圓孔，至硬腦膜前停止。用40 ℃溫水浸泡大鼠尾部2 min，待變軟后拭干，酒精表面消毒后斷尾取血50 μL，利用微量進(jìn)樣器沿圓孔垂直進(jìn)針5～6 mm，以20 μL/min滴速注入自體鼠尾血10 μL，觀察大鼠應(yīng)激情況，若無異常再用相同的方式注射完剩余40 μL自體血，注射后留針5 min，緩慢退針以免傷及腦部，約2 min完成退針。以骨蠟封鼠尾和針口，手術(shù)部位均用碘伏消毒、縫合，麻醉蘇醒前觀察大鼠生命體征，蘇醒后，從存活大鼠中以腦出血動物行為學(xué)分級結(jié)果選擇腦出血分級1～3級SD大鼠，根據(jù)性別分層隨機抽樣選擇取80只SD大鼠(雌雄各半)作為造模成功的最終實驗對象并回籠飼養(yǎng)。

1.3.2 給藥方法 在上述觀察時間點對各組實驗對象進(jìn)行神經(jīng)功能評價和腦組織摘除手術(shù)后處死，治療組給予10 mg/kg阿托伐他汀灌胃，對照組注射等量無菌生理鹽水，第一次給藥后每24 h給藥1次。

1.3.3 BWC的測定 在各觀察點神經(jīng)功能評估結(jié)束后對各組大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉劑為3.5%水合氯醛，大鼠意識完全喪失后，立即離斷頭頸部，開顱并取出腦組織，仔細(xì)探查造模時注入自體血的針眼區(qū)域，以針眼為中心做縱切將腦組織分為前、后兩個部分，取前腦組織置于安瓿瓶用電子天平，通過差值法計算前腦組織濕重N1；稱重后將前腦組織置于恒溫干燥箱中以(80～100)℃溫度烘烤24 h后取出，通過差值法計算腦組織干重N2，差值=NT-N0(N0為安瓿瓶空瓶重量)。BWC=(N1-N2)/N1×100%。稱重完成后，將剩余的腦組織置于甲醛溶液中加以固定，選取針眼附近出血灶進(jìn)行切片、HE染色，并對切片進(jìn)行AQP-4免疫組化檢測。

1.3.4 APQ-4表達(dá)免疫組化檢測 將剩余腦組織制成石蠟切片后送至病理科按照APQ-4 Elisa檢測試劑盒操作要求進(jìn)行免疫組化檢測，首先對樣本進(jìn)行脫蠟處理，并加入3%H2O2孵育20 min，用蒸餾水洗凈后置于搖床，加入PBS溶液浸泡5 min，加入封閉液山羊血清孵育5 min，吸去液體，用PBS溶液反復(fù)清洗3次，每次5 min。加入一抗兔抗鼠APQ-4，稀釋比例1∶100，37 ℃孵育30 min后用PBS溶液清洗3次，每次5 min，加入二抗辣根過氧化物酶底物，37 ℃孵育2 h后漂洗3次，每次5 min。加入顯色劑DAB，顯色后用蘇木精伊紅染液復(fù)染約10 s，后進(jìn)行脫水、透明處理，封片后置于生物顯微鏡下觀察顏色并捕捉影像，染色后，APQ-4表達(dá)為陽性的細(xì)胞細(xì)胞核應(yīng)呈棕褐色，隨機選取整個切片的5個視野攝像，用Image-Pro-Plus 6.0圖像分析軟件處理圖像，規(guī)定APQ-4陰性表達(dá)細(xì)胞吸光度為零，計算整體細(xì)胞的吸光度值(OD)并取平均值，OD越高，表明APQ-4陽性表達(dá)率越高。

1.4 評估標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 動物腦出血分級標(biāo)準(zhǔn) 在取自體血注射SD大鼠顱內(nèi)完成腦出血造模后約2 h，待大鼠蘇醒后動物行為根據(jù)動物行為學(xué)特征對大鼠的腦出血嚴(yán)重程度進(jìn)行評級，標(biāo)準(zhǔn)為：0級，大鼠神經(jīng)及動作行為均正常；1級，不能靈活、完全地伸展對側(cè)前爪；2級，癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈、追尾狀；3級，爬行時向?qū)?cè)傾倒或不能走路、意識喪失。造模后選取1～3級腦出血SD大鼠，飼養(yǎng)1 w后剔除死亡大鼠，根據(jù)性別分層抽樣選取80只腦出血SD大鼠造模成功并分組實驗。

1.4.2 大鼠神經(jīng)功能缺失評分標(biāo)準(zhǔn) 在給藥前第24 h、給藥后第96 h對兩組SD大鼠的神經(jīng)功能缺失程度進(jìn)行評分，采用Masao Shmi izu-Sasamata標(biāo)準(zhǔn)：(1)自主活動受限情況；(2)左前肢偏癱情況；(3)提尾時左前肢伸情況；(4)抗側(cè)推能力；(5)爬行時左傾斜度；(6)向左環(huán)行度；(7)觸須反應(yīng)，根據(jù)上述條目大鼠神經(jīng)缺損程度每項計0分(正常)、1分(中等異常)、2分(嚴(yán)重異常)，神經(jīng)功能缺失評分總分0～14分，評分越高，表明大鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 給藥前后兩組SD大鼠的神經(jīng)功能缺損程度分析

給藥前24 h，兩組SD大鼠的神經(jīng)功能缺損程度評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，給藥后96 h，治療組神經(jīng)功能缺損評分較給藥前顯著降低(P<0.05)，對照組神經(jīng)功能缺損評分較給藥前無顯著變化(P>0.05)，給藥后治療組SD大鼠的神經(jīng)功能缺損評分也明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 給藥前后兩組SD比較(分)

2.2 給藥前后兩組SD大鼠的BWC分析

給藥前24 h，兩組SD大鼠的BWC數(shù)值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，給藥后96 h，治療組BWC數(shù)值較給藥前顯著降低(P<0.05)，對照組BWC數(shù)值較給藥前無顯著變化(P>0.05)，給藥后治療組SD大鼠的BWC數(shù)值也明顯低于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 給藥前后兩組SD大鼠的BWC數(shù)值比較

2.3 給藥前后兩組SD大鼠的APQ-4表達(dá)情況

給藥前24 h，兩組SD大鼠的APQ-4陽性表達(dá)值均高于正常水平，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，給藥后96 h，治療組APQ-4陽性表達(dá)值均較給藥前顯著降低(P<0.05)，但給藥后治療組SD大鼠的APQ-4陽性表達(dá)值顯著低于對照組(P<0.01)，見表4，給藥前后顯微鏡下兩組SD大鼠腦組織免疫組化APQ-4表達(dá)情況，見圖1。

表4 給藥前后兩組SD大鼠的APQ-4陽性表達(dá)光密度值比較

2.4 給藥前后兩組SD大鼠的出血灶組織形態(tài)學(xué)分析

光學(xué)顯微鏡下，給藥前，兩組大鼠腦組織可見紅細(xì)胞聚集、明顯水腫伴隨炎性浸潤，出血灶面積、最大徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，給藥后96 h，治療組出血灶面積、炎癥浸潤均明顯減少，血腫灶組織形態(tài)學(xué)改善情況優(yōu)于對照組，見圖2。

3 討 論

腦出血是指在未出現(xiàn)腦外傷情況下腦內(nèi)血管破裂引發(fā)的顱內(nèi)出血疾病，在腦卒中患者中的發(fā)病率為20%～30%，相較于缺血性腦卒中(腦栓塞)而言，腦出血雖發(fā)病率較低，但患者在急性期的死亡率更高，可達(dá)到30%～50%[5-6]，在恢復(fù)期則有80%以上的患者伴隨神經(jīng)功能缺損和障礙。

目前，開顱手術(shù)是治療腦出血的有效手段，但開顱手術(shù)具有較高風(fēng)險，因手術(shù)造成的死亡率高達(dá)30%[7]，對于老年患者一般采取調(diào)脂、降壓、降糖、補充腦營養(yǎng)等藥物治療方法[8-9]。大量動物實驗和臨床數(shù)據(jù)表明[10-12]，腦出血患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死后，與其相鄰的腦組織細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的連接出現(xiàn)空隙，導(dǎo)致膜滲透壓改變、水分子轉(zhuǎn)膜出現(xiàn)障礙，這也使腦水腫嚴(yán)重程度與腦出血患者的預(yù)后出現(xiàn)了相關(guān)性聯(lián)系，即腦水腫面積越大，患者死亡率、致殘率越高，此外，腦水腫還能引發(fā)出血灶周邊的炎性浸潤和二次血管破裂和損傷，因此，減輕血管源性腦水腫是臨床治療腦出血的首要要求[13]。

水通道蛋白4(AQP-4)廣泛分布于腦組織、內(nèi)皮血管、蛛網(wǎng)膜下腔，參與腦組織細(xì)胞的水分子轉(zhuǎn)膜活動，具有清除胞間多余水分、維持腦細(xì)胞水平衡的重要作用，在腦出血時，AQP-4的表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)，且其表達(dá)水平與腦出血嚴(yán)重程度具有高度相關(guān)性，即出血灶越大、水腫面積越大，APQ-4表達(dá)水平越高。阿托伐他汀作為羥甲基戊二酸單酰輔酶還原酶抑制劑，具有抑制膽固醇合成、抗自由基氧化、抗炎、促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)等作用[14]，本文以腦出血SD大鼠模型為研究對象，通過分組給藥、比較不同觀察點大鼠的神經(jīng)功能缺損程度、出血灶四周組織形態(tài)學(xué)特點、BWC和AQP-4表達(dá)水平，探討了阿托伐他汀在消除腦水腫、重建腦組織神經(jīng)功能方面的積極作用，也試分析了阿托伐他汀對APQ-4代謝表達(dá)的調(diào)控關(guān)系和可能作用機制。

涂鄂文等的動物實驗[15]結(jié)果提示，10 mg/kg劑量的阿托伐他汀對腦出血大鼠的神經(jīng)功能的保護(hù)作用、腦水腫及出血灶組織形態(tài)學(xué)的改善水平最優(yōu)，本研究也采用該劑量進(jìn)行給藥。研究結(jié)果與涂鄂文等的研究結(jié)果具有一致性：即對腦出血SD大鼠模型給予阿托伐他汀可顯著改善大鼠神經(jīng)功能缺失水平、減輕BWC及腦水腫、減少出血灶和炎性浸潤灶，這也與阿托伐他汀能夠下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、AQP-4表達(dá)水平，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)表達(dá)水平有關(guān)。此外，本研究還著重探討了阿托伐他汀對AQP-4表達(dá)的影響，研究結(jié)果顯示，給藥后96 h，與給藥前相比，治療組大鼠腦組織切片中的AQP-4陽性表達(dá)光度值顯著降低，同時少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)分析，阿托伐他汀可能參與腦組織水分子轉(zhuǎn)膜過程的下述途徑：(1)平衡膠質(zhì)細(xì)胞參與的鈉鉀泵，疏通水分子通道、緩解腦水腫、消除血腦屏障；(2)抑制蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化作用，保護(hù)腦組織神經(jīng)功能；(3)抑制細(xì)胞膜去極化造成的鈣超載，減輕血管內(nèi)皮再灌注損傷。

綜上所述，將阿托伐他汀應(yīng)用于實驗性大鼠的腦出血模型的治療中對于大鼠神經(jīng)缺損情況、腦水腫、出血灶面積和AQP-4的表達(dá)均具有明顯的改善作用，值得進(jìn)一步進(jìn)行臨床試驗研究。