牟澤中 楊 宸 姜昊文

1 研究歷史

膀胱癌是發(fā)病率全球排名第九的癌癥，且膀胱癌患者所在地區(qū)、性別、年齡差異較大，約75%的高危膀胱癌患者在術(shù)后10年內(nèi)復(fù)發(fā)、進(jìn)展或死亡[1]。研究[2]表明，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著一定聯(lián)系。1976年，Sanger等[3]研究高等植物病毒時(shí)利用電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)了一類內(nèi)源性非編碼雙鏈閉合RNA，并將其命名為circRNA。但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)所限和認(rèn)知的局限性，并未引起重視[4]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者對(duì)circRNA有了新的認(rèn)識(shí)。與此同時(shí)，由于circRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有著極高的豐富度、穩(wěn)定性，以及高度保守性，使其成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。1991年，Nigro等[5]在研究潛在腫瘤抑制基因DCC基因時(shí)首次發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)源性circRNA。隨后的研究[6-7]結(jié)果顯示，circRNA在糖尿病、高血壓、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、胃癌、肝癌、乳腺癌和膀胱癌中有著廣泛的表達(dá)。但circRNA在膀胱癌中研究的深度和廣度尚顯不足。

2 生物結(jié)構(gòu)特征

Braun等[8]研究結(jié)果表明，剪切機(jī)制可以使外顯子環(huán)化。而大多數(shù)的circRNA來源于編碼蛋白的基因，這使得大多數(shù)circRNA也會(huì)含有完整的外顯子，因此可以推測circRNA主要是通過RNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ)轉(zhuǎn)錄而成且受剪切機(jī)制的調(diào)控[9]。線性RNA同樣來源于編碼蛋白的基因，且受剪切機(jī)制影響。與線性RNA不同，circRNA通過將3’和5’末端結(jié)合在一起并進(jìn)行獨(dú)特的反向剪接使circRNA分子環(huán)化[9]。正是由于circRNA是一個(gè)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，無游離的5’帽端和 3’Poly A尾端[10]；相比線性RNA，circRNA受核酸外切酶的影響較小，故其保守性和穩(wěn)定性也更強(qiáng)。

3 分類與形成方式

circRNA可被分為4類：僅包含外顯子的circRNA(EcircRNA)，僅包含內(nèi)含子的circRNA(ciRNA)，同時(shí)包含外顯子和內(nèi)含子的circRNA(EIciRNA)，以及由轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、核糖體RNA(rRNA)環(huán)化而形成的circRNA[11]。目前公認(rèn)有3種合成方式：外顯子套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化、內(nèi)含子驅(qū)動(dòng)環(huán)化、RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)環(huán)化。外顯子套索環(huán)化機(jī)制依賴于“外顯子跳躍”機(jī)制，通過外顯子的跳躍使得RNA長鏈折疊，3’剪接供體與5’剪接受體的共價(jià)剪接并形成同時(shí)包含環(huán)狀和線性產(chǎn)物的套索結(jié)構(gòu)，通過剪接體去除內(nèi)含子，形成一個(gè)只有外顯子的環(huán)狀RNA。內(nèi)含子配對(duì)環(huán)化機(jī)制主要依賴于RNA的結(jié)構(gòu)序列特異性，一些RNA的外顯子兩端的內(nèi)含子是互補(bǔ)配對(duì)的，反向互補(bǔ)配對(duì)的內(nèi)含子直接結(jié)合使得RNA環(huán)化，去除內(nèi)含子形成circRNA[12]。Jeck等[13]在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子配對(duì)環(huán)化機(jī)制的發(fā)生概率高于套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化機(jī)制的發(fā)生概率。RNA結(jié)合蛋白(RBP)主要通過RBP結(jié)合到circRNA側(cè)翼的內(nèi)含子上進(jìn)而調(diào)控環(huán)化。RBP Quaking (QKI)可以調(diào)控circRNA的生物合成。目前，關(guān)于膀胱癌中的circRNA的環(huán)化機(jī)制尚無足夠、確切的研究結(jié)論以明確提示circRNA在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制可作為今后研究的切入點(diǎn)。

4 circRNA在膀胱癌中的生物學(xué)功能

4.1 作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)調(diào)控微RNA(miRNA)活性 ceRNA假說是目前研究最為深入，且得到廣泛公認(rèn)的作用機(jī)制。circRNA含有大量的miRNA靶點(diǎn)，使其能夠競爭性地與miRNA結(jié)合，使有活性的miRNA減少，進(jìn)而影響信使RNA(mRNA)的作用表達(dá)。Hansen等[14]的研究證明，有著70多個(gè)miRNA結(jié)合靶點(diǎn)的circRNA ciRS-7可充當(dāng)miRNA-7海綿，并強(qiáng)烈抑制miRNA-7活性，導(dǎo)致miRNA-7的表達(dá)水平降低。circRNA的海綿吸附機(jī)制在膀胱癌中也有體現(xiàn)，Sun等[15]研究發(fā)現(xiàn)circ_0058063可以充當(dāng)miRNA-145-5p的海綿，通過調(diào)節(jié)周期蛋白依賴性激酶(CDK)6表達(dá)來加速膀胱癌的進(jìn)展。

4.2 與RBP反應(yīng) circRNA不僅可以作為miRNA海綿，還可以作為RBP海綿。研究[9]證明circMbl可以與甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)直接相互作用，使circMbl通過與線性剪接競爭而在基因調(diào)控中發(fā)揮作用。但目前此功能尚未有膀胱癌方面的記錄報(bào)道。

4.3 circRNA編碼蛋白質(zhì)翻譯 早期研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可以通過海綿作用吸附miRNA來影響mRNA的表達(dá)進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的翻譯，但circRNA對(duì)蛋白質(zhì)的調(diào)控遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這些。Mo等[16]利用內(nèi)含子增強(qiáng)體系技術(shù)(IME)檢測到了翻譯蛋白質(zhì)的circRtn4。Legnini等[17]發(fā)現(xiàn)了circ-ZNF609可以編碼控制肌細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)，為真核生物circRNA編碼蛋白質(zhì)又提供了一個(gè)證據(jù)。該發(fā)現(xiàn)使得在circRNA生物學(xué)功能方面的研究進(jìn)入新的領(lǐng)域。

5 環(huán)狀RNA在膀胱癌中的研究進(jìn)展

5.1 在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)的circRNA circRNA對(duì)于膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展有著重要的作用。一些circRNA會(huì)加速膀胱癌的進(jìn)展，通過研究了解這些促癌circRNA的作用機(jī)制，可以為膀胱癌的臨床治療和早期篩查提供新思路。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)，circDOCK1在膀胱癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)。通過抑制circDOCK1可以降低膀胱癌細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞增殖和膀胱癌細(xì)胞的遷移能力。其通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，circDOCK1調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞中circDOCK1/hsa-miRNA-132-3p/Sox5途徑發(fā)揮作用，而通過體內(nèi)異種移植腫瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)circDOCK1可以抑制腫瘤的生長，進(jìn)而為膀胱癌的治療提供了潛在的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。Bi等[19]通過對(duì)膀胱癌和癌旁組織的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，circRNA染色質(zhì)重塑因子(circ-BPTF)在膀胱癌中表達(dá)增加，其通過海綿吸附miRNA-31-5p來調(diào)節(jié)膀胱癌的進(jìn)展；研究還證實(shí)，miRNA-31-5p可以直接與致癌基因RAS癌基因家族成員RAB27A結(jié)合使其表達(dá)下調(diào)。通過抑制circ-BPTF的表達(dá)可以有效延緩癌癥的進(jìn)展，因而circ-BPTF對(duì)于膀胱癌的臨床診治有著重要的作用與影響。而Yang等[20]則利用生物信息學(xué)分析的方法，首先預(yù)測了可以與circRNA紫外線抵抗相關(guān)基因(circ-UVRAG)潛在結(jié)合的miRNA-223，然后再利用生物信息學(xué)分析工具預(yù)測miRNA-223的下游靶基因成纖維生長因子受體2(FGFR2)基因，并同時(shí)利用癌癥組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫對(duì)膀胱癌患者FGFR2表達(dá)進(jìn)行生存預(yù)后分析，最后通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方式證明了通過抑制circ-UVRAG可以降低FGFR2的表達(dá)，延緩膀胱癌的進(jìn)展。該文從生物信息學(xué)方法入手，提供了一個(gè)新的研究思路與方法。此外，還有很多關(guān)于circRNA在膀胱癌進(jìn)展中的研究報(bào)道，這些高表達(dá)的環(huán)狀RNA可以不同程度地促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲[21-26]。同時(shí)，也有諸多將生物信息學(xué)分析與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的研究[24,27-28]；這些研究充分利用生物信息學(xué)在基因表達(dá)量和預(yù)后生存時(shí)間等臨床信息的數(shù)據(jù)，將生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)結(jié)果與其研究中的測序結(jié)果相結(jié)合，利用基因芯片數(shù)據(jù)平臺(tái)(Gene Expression Omnibus,GEO)、TCGA等公共數(shù)據(jù)庫對(duì)膀胱癌的芯片、測序樣本進(jìn)行差異分析，選取差異表達(dá)的circRNA；再根據(jù)臨床信息進(jìn)一步篩選有臨床意義的circRNA，即在臨床預(yù)后或病理分期等有顯著差異的circRNA。在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)的circRNA及其調(diào)控的miRNA和mRNA見表1。

表1 在膀胱癌中表達(dá)上調(diào)的circRNA

UBAC2為泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白2，SOX5為SYN轉(zhuǎn)錄因子5，PROK2為植物表達(dá)載體2，F(xiàn)OXP4為叉頭框蛋白4，CARMA3為凋亡蛋白募集結(jié)構(gòu)域和膜相關(guān)鳥苷酸激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白3，MTGR1為髓易位基因相關(guān)蛋白1，CREB1為環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1

5.2 在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)的circRNA 另一些circRNA在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)。Sun等[29]證明了circRNA CEP128可以通過調(diào)控miRNA-145-5p/Myd88信號(hào)通路來加速膀胱癌的進(jìn)展。miRNA-145-5p在膀胱癌中表達(dá)是降低的，而circCEP128可以與miRNA-145-5p靶向結(jié)合，miRNA-145-5p又可與Myd88 靶向結(jié)合，所以敲除circCEP128可使miRNA-145-5p的表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶(MAKP)信號(hào)通路和相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)來加速腫瘤的進(jìn)展。 同一個(gè)circRNA在不同的組織或細(xì)胞中發(fā)揮的作用有時(shí)也是不一樣的。研究[30]證實(shí)circRNA-小腦變性相關(guān)蛋白1反義RNA (Cdr1as)在肝細(xì)胞癌中會(huì)加速腫瘤的生長，但是在膀胱癌中circRNA-Cdr1as卻起到抑癌作用。Li等[31]證明，circRNA-Cdr1as可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)。circRNA-Cdr1as可以同時(shí)吸附多個(gè)miRNA，包括miRNA-7、miRNA-135a和miRNA-1290，尤其是miRNA-7和miRNA-135a[31]。circRNA對(duì)于進(jìn)展性膀胱癌的抑制作用也有報(bào)道。Bi等[32]通過研究不同侵襲性的膀胱癌后發(fā)現(xiàn)，circ-ZKSCAN1對(duì)于膀胱癌細(xì)胞的生長、增殖和遷移起到了顯著抑制作用，并發(fā)現(xiàn)circ-ZKSCAN1的低表達(dá)與膀胱癌的緩解率低、復(fù)發(fā)率高和腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，通過促進(jìn)circ-ZKSCAN1的表達(dá)，可以有效地抑制膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，并非所有低表達(dá)的circRNA都能延緩膀胱癌進(jìn)展，Su等[33]的研究結(jié)果提示，hsa_circ_RIP2可以通過靶向吸附miRNA-1305并提高TGF-β2的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程。但hsa_circ_RIP2在腫瘤患者中呈低表達(dá)，且表達(dá)量越低的患者預(yù)后越差。通過檢測免疫相關(guān)分子對(duì)這種相互矛盾的現(xiàn)象進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，患者趨化因子CCL2、CCL3、CXCL5、CXCL17、CXCL20，以及細(xì)胞因子IL-6、IL-13、IL-17均發(fā)生了顯著的變化。此外還發(fā)現(xiàn)，在hsa_circ_RIP2高表達(dá)的患者體內(nèi)，有更多的CD3+/CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤，提示circRNA對(duì)于腫瘤的調(diào)控有著更深層次的分子機(jī)制，即在個(gè)體水平上，促癌的circRNA可能通過與腫瘤免疫微環(huán)境互相調(diào)控最終發(fā)揮一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控腫瘤的作用。此外，膀胱癌的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是膀胱癌患者預(yù)后和生存期的主要影響因素，而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)是細(xì)胞向肌肉內(nèi)的增殖和侵襲[34]，而目前這種機(jī)制尚未有確切的研究報(bào)道，因而circRNA對(duì)于腫瘤侵襲的作用將是未來研究的一個(gè)新思路,諸如circFUT8、circFOXO3等在膀胱癌中差異低表達(dá)的circRNA對(duì)于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有著抑制作用，這些低表達(dá)circRNA可以作為未來研究的一些潛在的治療靶點(diǎn)[35-36]。在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)的circRNA及其調(diào)控的miRNA和mRNA見表2。

表2 在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)的circRNA

TGFBR2為TGF-β2受體，CCNE1為細(xì)胞周期蛋白E1，PIK3Cd為磷酸肌醇-3激酶催化亞基δ肽，KLF為kruppel樣因子

6 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用進(jìn)一步推動(dòng)了circRNA的深入研究與探索。通過腫瘤本體(Gene Ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Gens and Genomes，KEGG)通路分析等技術(shù)可以預(yù)測circRNA在通路表達(dá)的差異，再利用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建技術(shù)可以預(yù)測差異表達(dá)的circRNA可能參與的通路，這些生物信息學(xué)技術(shù)分析的結(jié)果為后續(xù)的深入研究提供了指導(dǎo)方向。但關(guān)于circRNA在不同分期的膀胱癌中表達(dá)的信息仍然非常有限，這也提示應(yīng)對(duì)不同臨床病理分期的膀胱癌開展進(jìn)一步研究，提高膀胱癌的診斷準(zhǔn)確率、治療效果，以及改善預(yù)后。Li等[37]利用對(duì)circRNA進(jìn)行測序并進(jìn)行GO和KEGG分析來探索circRNA的生物學(xué)功能，通過R包富集分析富含circRNA的基因的生物學(xué)過程，并利用STRING構(gòu)建PPI，初步確定了hsa_circ_0137606與miRNA-1231的相互作用，再通過后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，最后得出結(jié)論：hsa_circ_0137606通過海綿作用吸附miRNA-1231來抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。生物信息學(xué)分析也同樣可以應(yīng)用于預(yù)測circRNA與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系，Liu等[38]通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了7 282組差異表達(dá)的circRNA，并建立了12組circ-RNA 的差異表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，通過進(jìn)一步的預(yù)后分析，得出與hsa-miRNA-106b、hsa-miRNA-145 和hsa-miRNA-214相互作用的circRNA與膀胱癌患者的總體存活率有關(guān)，而hsa_circ_0076704、hsa_circ_0081963 和hsa_circ_0001361與膀胱癌患者的中位總生存期有關(guān)。

7 總 結(jié)

近年來，眾多研究尤其是膀胱癌的研究都是基于其通過海綿作用吸附miRNA抑制mRNA 的表達(dá)來調(diào)控腫瘤進(jìn)展的這一機(jī)制進(jìn)行的。但是其作為編碼蛋白質(zhì)翻譯及其與RNA結(jié)合蛋白質(zhì)直接結(jié)合的作用方式的研究結(jié)果較少。對(duì)于膀胱癌來說，未來的研究不僅要基于海綿吸附這一機(jī)制，更要探索在編碼蛋白質(zhì)翻譯等生物學(xué)功能等方面的研究，尋找潛在的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)和通路。