袁天杰 趙子君 陳 依 鄢和新 俞衛(wèi)鋒

膿毒癥與感染、免疫系統(tǒng)平衡被破壞等損傷相關(guān)，是導(dǎo)致重要器官功能障礙的嚴(yán)重全身性疾病。感染誘發(fā)的膿毒癥(如菌血癥)可刺激宿主的免疫系統(tǒng)釋放過(guò)量的促炎癥細(xì)胞因子(簡(jiǎn)稱(chēng)促炎因子)進(jìn)入血液循環(huán)[1-2]。膿毒癥引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙被認(rèn)為是急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的主要發(fā)生機(jī)制，該機(jī)制與死亡率顯著相關(guān)[3-4]。

內(nèi)皮細(xì)胞在白細(xì)胞的黏附和遷移中起著重要作用。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到諸如細(xì)菌的感染，可引起機(jī)體血管屏障受損，導(dǎo)致血管通透性增加，致使液體滲漏和炎癥細(xì)胞遷移。隨著病程的進(jìn)展，機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，黏附分子的表達(dá)水平上調(diào)，促進(jìn)免疫細(xì)胞的黏附與遷移。因此，恢復(fù)內(nèi)皮的完整性、增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定性，對(duì)治療膿毒癥引起的ALI和改善患者的預(yù)后至關(guān)重要。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)廣泛存在于各類(lèi)間充質(zhì)組織中。該類(lèi)細(xì)胞具有自我更新并分化成各種細(xì)胞譜系的能力。越來(lái)越多的研究[5-7]結(jié)果表明，MSC對(duì)諸多血管性疾病均有益處，如缺血性心肌病、敗血癥和ALI等；但相關(guān)分子作用機(jī)制尚未完全明確。目前的研究結(jié)論為，MSC的治療作用可能與其分泌的外泌體有關(guān)。MSC釋放體液因子來(lái)調(diào)節(jié)局部或全身免疫反應(yīng)，其中包括外泌體的調(diào)節(jié)作用[8-9]。外泌體是近期研究的焦點(diǎn)。外泌體可將功能性信使核糖核酸(mRNA)、微核糖核酸(miRNA)和其他生物化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的通信。研究[10-12]發(fā)現(xiàn)，外泌體通過(guò)調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展起到調(diào)控作用，如骨性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、皮膚創(chuàng)面的修復(fù)等。脂質(zhì)體膜可以保護(hù)外泌體免于降解，故存儲(chǔ)簡(jiǎn)便。因此，外泌體是具有臨床應(yīng)用前景的治療工具。本研究旨在探索MSC來(lái)源的外泌體對(duì)受損的內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 臍帶組織由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院提供。高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素混合液、丙氨酰谷氨酰胺均購(gòu)自上海源培生物科技公司?？俁NA抽提試劑(TRIzol)、RIPA裂解液、SYBR Green核酸染料、硝酸纖維素膜、BCA蛋白測(cè)定、TUNEL凋亡測(cè)定和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建城生物工程研究所。胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。牛血清白蛋白(BSA)、脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。一抗TSG101(兔)購(gòu)自美國(guó)Protein Tech公司。CD63、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。CD81抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。辣根過(guò)氧化物(HRP)偶聯(lián)的羊抗鼠二抗IgG購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。相關(guān)引物均由上海華津生物科技公司合成與提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MSC來(lái)源外泌體(MSC-Exos)的分離與鑒定 采用組織貼壁法從人臍帶組織中分離出MSC，培養(yǎng)于含有5%FBS和1%青霉素鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基中。將MSC接種在含完全培養(yǎng)基的15 cm培養(yǎng)皿中直至細(xì)胞完全融合，后換液為15 mL無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集上述條件培養(yǎng)基，2 000×g，4 ℃，離心30 min以除去細(xì)胞碎片。應(yīng)用超速離心機(jī)100 000×g，室溫離心2 h，棄去上清液，分離出外泌體，重懸于1×PBS中。應(yīng)用透射電子顯微鏡(簡(jiǎn)稱(chēng)電鏡)觀察外泌體形態(tài)。將外泌體在室溫下固定于含1.25%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合溶液中2 h，后以1×PBS洗滌樣品2次，再以1.5%乙酸鈾酰負(fù)染2 min，并拍照、記錄外泌體形態(tài)。使用納米顆粒跟蹤(NTA)技術(shù)分析外泌體的直徑和總數(shù)，免疫印跡法測(cè)定外泌體的標(biāo)記蛋白CD63和TSG101，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD63和CD81。

1.2.2 分組、模型和干預(yù) 將HUVEC培養(yǎng)于含10%FBS和1%青霉素鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基中至完全融合。隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組、MSC-Exos組，每組均有3個(gè)重復(fù)樣本。對(duì)照組在不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，LPS組添加100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/L LPS孵育24 h，MSC-Exos組添加100 μL質(zhì)量濃度為1 mg/L LPS和100 mg/L的外泌體孵育24 h。

1.2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將1×105HUVEC接種于六孔板培養(yǎng)皿中，并在含10% FBS和1%青霉素鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞完全融合。以200 μL移液器尖端手動(dòng)刮擦細(xì)胞表面，在每個(gè)孔中產(chǎn)生垂直傷口。分別于處理即刻、處理后12和24 h，應(yīng)用Image J軟件分析細(xì)胞遷移區(qū)域。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少2次。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)目的基因表達(dá) ①總RNA提取，采用TRIzol裂解液裂解各組細(xì)胞，并提取細(xì)胞總mRNA。②反轉(zhuǎn)錄，按照SYBR Green qPCR Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟，將提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。③實(shí)時(shí)定量PCR法，以18S核糖體RNA(18SrRNA)作為管家基因，以cDNA為模板行目的基因擴(kuò)增。采用ΔΔCt法檢測(cè)各組樣本中基因的表達(dá)水平，擴(kuò)增后目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MPO含量檢測(cè) 根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)量各組細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MPO含量，利用分光光度計(jì)進(jìn)行結(jié)果定量，了解細(xì)胞氧化應(yīng)激程度。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡分析 將外泌體或HUVEC溶解在帶有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒定量各組細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度。樣品經(jīng)過(guò)8%～10% SDS-PAGE處理，電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。將膜用5%BSA封閉1 h后，浸泡于一抗中，4 ℃孵育過(guò)夜，后與適當(dāng)?shù)腍RP偶聯(lián)的二抗共同孵育。最后，通過(guò)信號(hào)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞目的蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度，并以GAPDH(購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司)作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參。應(yīng)用Image J軟件對(duì)各條帶熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。

1.2.7 細(xì)胞凋亡評(píng)估 采用TUNEL凋亡試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞凋亡程度。4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色歸一化凋亡細(xì)胞核。使用顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用Image J軟件對(duì)其進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 MSC-Exos形態(tài)與性質(zhì)的鑒定 透射電鏡圖像顯示，本實(shí)驗(yàn)提取的外泌體呈球狀，其直徑范圍為30～100 nm。見(jiàn)圖1A。免疫印跡法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，提取的外泌體表達(dá)CD63、CD81和TSG101。見(jiàn)圖1B和1C。NTA結(jié)果表明，分離的微囊泡(含外泌體)平均濃度為4.05×1010/mL，直徑范圍為30～150 nm。見(jiàn)圖1D。

2.2 MSC-Exos干預(yù)LPS對(duì)HUVEC功能損傷的影響 MSC-Exos組的HUVEC遷移面積顯著大于LPS組(P<0.01)。見(jiàn)圖2、表2。TUNEL染色細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS組HUVEC細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著多于對(duì)照組(P<0.05)，而MSC-Exos組的HUVEC細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著少于LPS組(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖3。

A 外泌體透射電鏡圖像 B 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體CD63和CD81的表達(dá) C 免疫印跡法檢測(cè)外泌體CD63和TSG101的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量 D NTA檢測(cè)的外泌體濃度和直徑范圍圖1 MSC-Exos形態(tài)與性質(zhì)鑒定

A 對(duì)照組0 h B 對(duì)照組12 h C 對(duì)照組24 h D LPS組0 h E LPS組12 h F LPS組24 h G MSC-Exos組0 hH MSC-Exos組12 h I MSC-Exos組24 h圖2 3組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移面積

表2 3組細(xì)胞12 h、24 h細(xì)胞遷移面積和凋亡數(shù)量比較

2.3 MSC-Exos緩解LPS誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激損傷 與對(duì)照組相比，LPS組HUVEC細(xì)胞SOD活性顯著減弱(P<0.05)、 MPO表達(dá)量顯著增多(P<0.01)。與LPS組相比，MSC-Exos組HUVEC細(xì)胞SOD活性顯著增強(qiáng)(P<0.01)、MPO表達(dá)量顯著減少(P<0.05)?；蛩降臋z測(cè)結(jié)果顯示，LPS組促炎因子(TNF-α和IL-1β)的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著增多(P<0.05)。與LPS組相比，MSC-Exos組HUVEC細(xì)胞TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.05)，抗炎細(xì)胞因子(IL-10 mRNA)表達(dá)量顯著增多(P<0.01)。見(jiàn)表3。

A 對(duì)照組樣本1 B 對(duì)照組樣本2 C LPS組樣本1D LPS組樣本2 E MSC-Exos組樣本1 F MSC-Exos組樣本2圖3 3組細(xì)胞TUNEL法檢測(cè)結(jié)果

表3 MSC-Exos干預(yù)減輕LPS誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激損傷

2.4 MSC-Exos調(diào)控LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞間內(nèi)皮黏附分子表達(dá)水平 ICAM-1和VCAM-1是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志。VE-cadherin可減輕炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。與LPS組相比，MSC-Exos組HUVEC細(xì)胞的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)水平顯著降低，VE-cadherin水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表4。

1 對(duì)照組 2 LPS組 3 MSC-Exos組圖4 MSC-Exos調(diào)控LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞間內(nèi)皮黏附分子表達(dá)

表4 MSC-Exos調(diào)控LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞間內(nèi)皮黏附分子相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

廣泛的微血管損傷和內(nèi)皮功能障礙是膿毒癥的病理生理學(xué)標(biāo)志，與嚴(yán)重的全身性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞連接整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)，維持內(nèi)皮屏障完整性在體內(nèi)平衡中起著至關(guān)重要的作用[13-14]。內(nèi)皮的損傷和功能障礙使得微血管屏障被破壞，導(dǎo)致組織水腫和器官功能障礙的增加[15]。在內(nèi)皮損傷狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞的激活會(huì)增加促炎因子的釋放、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，循環(huán)白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附募集并增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[16]。免疫過(guò)度激活會(huì)使宿主免疫系統(tǒng)癱瘓。

近年來(lái)，越來(lái)越多證據(jù)顯示了MSC的抗炎特性[17-19]。然而，將MSC直接用于治療仍存在一些風(fēng)險(xiǎn)，如免疫排斥、低存活率、微脈管系統(tǒng)阻塞，以及不適當(dāng)?shù)募?xì)胞分化和腫瘤生成等。

而外泌體作為一種新型的載體可以轉(zhuǎn)運(yùn)各種大分子并介導(dǎo)細(xì)胞間通信。細(xì)胞選擇性地將特定的非編碼RNA包裝進(jìn)外泌體，主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至鄰近細(xì)胞[20-21]。外泌體為運(yùn)輸功能性生物化學(xué)物質(zhì)，可調(diào)控細(xì)胞并影響微環(huán)境。但是，對(duì)于外泌體的潛在功能仍有待進(jìn)一步研究。

本研究以評(píng)估MSC來(lái)源的外泌體對(duì)內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用為目的，以1 mg/L的LPS處理HUVEC誘導(dǎo)損傷。然后，使用外泌體與HUVEC共孵育12 h以探索MSC-Exos的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，提取的外泌體呈球狀，具有典型的外泌體表面標(biāo)記。同時(shí)，MSC-Exos顯著增強(qiáng)了HUVEC的遷移能力，并減少了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

MPO和SOD活性的相關(guān)結(jié)果表明，LPS升高了HUVEC的氧化應(yīng)激水平，而MSC-Exos明顯減弱了此作用。故上述結(jié)果顯示，MSC-Exos可介導(dǎo)促炎癥和抗炎癥狀態(tài)之間的平衡。

細(xì)胞間內(nèi)皮黏附分子包括ICAM-1和VCAM-1，是中性粒細(xì)胞黏附的關(guān)鍵細(xì)胞表面糖蛋白。內(nèi)毒素通過(guò)NF-κB活化來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)皮活化而增加黏附力[22]。VE-cadherin為血管舒張劑，是心血管系統(tǒng)的保護(hù)因子，在控制炎癥介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本研究顯示，MSC-Exos抑制了HUVEC中LPS誘導(dǎo)的黏附分子表達(dá)；同時(shí)，VE-cadherin表達(dá)水平顯著升高。

綜上所述，MSC-Exos通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移能力，以及抗炎癥和抗凋亡能力，從而減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。未來(lái)仍有一些工作可繼續(xù)探究：首先，優(yōu)化提取方法以獲得高純度的外泌體；其次，可進(jìn)一步研究明確MSC-Exos對(duì)于炎癥影響的具體信號(hào)傳導(dǎo)途徑。這些工作將為MSC-Exos臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。