虞冰，林琴，張春榮，吳園園，郭鈐，湯濤*

(1.金華市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量綜合監(jiān)督檢測中心，浙江 金華 321017； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)是一類干擾生物體內(nèi)分泌的外源性物質(zhì)，此類物質(zhì)在環(huán)境中的濃度較低，急性毒性較弱，但能引起生物體的生殖障礙、代謝紊亂、發(fā)育異常及某些癌癥(如乳腺癌、睪丸癌、前列腺癌等)的發(fā)生[1-2]。1996年12月，歐盟首次討論了內(nèi)分泌干擾物對人體和其他生物體的影響，并將烷基酚類(APs)列為其中一類內(nèi)分泌干擾物，APs因具有明顯的環(huán)境雌激素效應(yīng)而引起廣泛關(guān)注和研究[3]。

烷基酚聚氧乙烯醚(APEOs)屬于非離子型表面活性劑，具備良好的潤濕性、分散性、洗滌性、乳化性、增溶和滲透作用，可廣泛應(yīng)用于日用化工行業(yè)，如制備洗滌劑、造紙、紡織印染、冶金、制藥、農(nóng)藥、印刷、合成樹脂、合成橡膠、塑料等行業(yè)[4]。APEOs包括約80%的壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)、約15%的辛基酚聚氧乙烯醚(OPEOs)、約1%十二烷基酚聚氧乙烯醚(DPEO)和二壬基酚聚氧乙烯醚(DNPEO)[5-6]。

毒性、生物降解性、環(huán)境激素和在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的有害副產(chǎn)物是APEOs產(chǎn)生危害的主要方面[7]。APEOs具有環(huán)境激素效應(yīng)，已被國際列為禁用的70種環(huán)境激素之一。APEOs的降解產(chǎn)物APEO1-2和APs具有食物鏈的生物累積效應(yīng)，APEO1-2和APs可在低級生物中聚集，再通過食物鏈在更高一級的生物體體內(nèi)富集，當(dāng)APEOs及代謝物在人體內(nèi)累積達(dá)到一定量時容易致病和中毒，APEOs及其代謝物對人體主要的危害是與雌激素受體結(jié)合，從而影響人體正常激素分泌，導(dǎo)致生殖器官異常、精子數(shù)量減少等[8-9]。APEOs單體的溶解性隨著APEOs鏈長逐漸的縮短而減弱，毒性則是隨著鏈長的縮短而增強。相較于APEOs，APs對水生物的毒性更高，魚類和海藻對NPEO1-2的急性毒性范圍為4 600～14 000 μg·L-1，NP的急性毒性范圍則為17～3 000 μg·L-1，依據(jù)美國環(huán)保署(EPA)的制定標(biāo)準(zhǔn)，NPEO1-2為中等毒性，NP為高毒性[9]。因此，這些物質(zhì)對環(huán)境和人類健康造成很大的威脅。APEOs在自然環(huán)境中普遍存在且濃度較低，環(huán)境中APEOs含量的測定對檢測方法的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性要求較高，建立并驗證可靠的檢測方法尤為重要。

1 烷基酚聚氧乙烯醚及烷基酚的檢測技術(shù)進(jìn)展

檢測不同的基質(zhì)中的APEOs及其代謝產(chǎn)物，所選的儀器不同，前處理方法也不同。如表1所示，一般檢測固態(tài)基質(zhì)中的APEOs和APs，通常采用甲醇作為萃取劑，超聲萃取或固相萃取，接著進(jìn)行氮吹，定容后待檢測。而對于液態(tài)基質(zhì)，通常采用乙腈、甲醇或正己烷作為萃取劑，液-液萃取，接著過柱后過0.22 μm膜，待檢測。因此，在今后的研究中，在檢測APEOs和APs選取前處理方法時，要考慮基質(zhì)對檢測的影響。

表1 檢測技術(shù)的前處理方法

1.1 烷基酚聚氧乙烯醚及烷基酚樣品的前處理方法

前處理的目的是將目標(biāo)化合物從基質(zhì)中分離出來，降低基質(zhì)干擾，使其成可檢測、可分析狀態(tài)。檢測APEOs和APs的前處理方法的步驟一般為提取、凈化和濃縮。而前處理提取方式有索氏提取法、液-液萃取法、微波萃取法、超聲萃取法、固相萃取和QuEChERS法等。

1.1.1 索氏提取

索氏提取法是利用相似相溶和虹吸原理，用溶劑將固體長期浸潤，將待提取的物質(zhì)浸出來。常用的提取溶劑有乙腈、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、石油醚和正己烷等。陳武炯[11]利用150 mL甲醇經(jīng)索氏提取器提取5 h，檢測紡織品中的APs和APEOs殘留，該方法回收率為80%～95%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%～4.6%(n=5)。GB/T 23322—2009[21]規(guī)定了紡織品中APEOs檢測的前處理方法以甲醇為提取溶劑，索氏提取3 h，該方法回收率為90%～110%，RSD<10%，該標(biāo)準(zhǔn)已于2018年被GB/T 23322—2018[22]替換。索氏提取法提取效率雖高，但所需溶劑消耗量大、提取的時間長，操作也較為復(fù)雜。

1.1.2 液-液萃取

液-液萃取原理是依據(jù)目標(biāo)化合物在不同溶劑中的溶解度不同，進(jìn)而將其從另一種溶劑中分離出來。常用的萃取溶劑有乙酸乙酯、甲醇、氯仿、二氯甲烷和乙腈等。液-液萃取主要應(yīng)用于提取液態(tài)基質(zhì)中APEOs及其代謝物。Li等[14]用甲醇提取飲料中的NP和OP，方法回收率為82%～94%，RSD<3.2%。蔡素婷等[20]用50%硫酸溶液調(diào)節(jié)1 L水樣的pH至小于2后，用60 mL的二氯甲烷反復(fù)提取3次，濃縮后用正丙酮定容、N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷(BSTFA+TMCS，體積比99∶1)衍生0.5 h，經(jīng)GC/MS分析后，4-t-OP、NP、4-t-OPEO1-2和NPEO1-24種化合物的回收率85%～110%，RSD為5.1%～8.8%。孫彥[19]也利用二氯甲烷做萃取溶劑提取水中的p-t-OP、AP和APEO1-2，回收率為84%～103%，RSD為5.8%～13.0%。液-液萃取法優(yōu)點是回收率高、重現(xiàn)性好，缺點是提取溶劑量較大、萃取時容易形成乳液，需進(jìn)一步分離，且該方法適合提取簡單的基質(zhì)中短鏈的APEOs和代謝物，當(dāng)基質(zhì)體系較為復(fù)雜時，提取效果不理想。

1.1.3 微波萃取

微波萃取主要是利用微波的熱效應(yīng)，加速化合物的運動，使其被有效提取。王成云等[16]用甲醇作萃取劑微波萃取30 min，反復(fù)萃取2次紡織品中的NP、OP、NPEO3-16和OPEO3-16，方法回收率達(dá)93%～104%，RSD<5%，方法檢測限為0.01～0.025 mg·L-1。微波萃取法的優(yōu)點是設(shè)備簡單、萃取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)省時間和試劑等優(yōu)點。

1.1.4 超聲提取

超聲提取的原理是利用超聲波的空化效應(yīng)和次級作用，促進(jìn)化合物和基質(zhì)的分離和促進(jìn)化合物與提取溶劑的融合。黃芳等[10]用甲醇和水的混合溶液提取紡織品中的APEOs，回收率為91%～98%，RSD<5%。蒲愛軍等[23]以甲醇為溶劑超聲波萃取紡織染整助劑產(chǎn)品中殘留的NP、OP、NPEO2-17和OPEO2-17，回收率為98%～102%，RSD均<5%。左瑩等[24]用乙腈做萃取劑，分別超聲5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70 min后，測定紙中APEOs的含量。結(jié)果表明：超聲萃取時長超過35 min后，提取效率相近，最終選擇用乙腈超聲萃取35 min，該方法回收率為51%～117%，其中OPEO2、NPEO2-4、NPEO14-20回收率不足70%，RSD為2%～12%。超聲萃取法操作簡單，但僅對APs和特定聚合度的APEOs提取效率較高。

1.1.5 固相萃取

固相萃取法通過選擇性吸附目標(biāo)組分和選擇合適的洗脫液，凈化并分離出目標(biāo)組分。林琴[25]用甲醇-水溶液提取茶鮮葉、干茶和茶湯中的APEOs，經(jīng)HLB固相萃取柱富集和凈化、再用含5%二氯甲烷甲醇溶液淋洗，3種基質(zhì)中的回收率分別為32%～111%、61%～112%和72%～117%，RSD<20%。王金成等[18]將海水經(jīng)C18固相萃取柱富集凈化后，用20%甲醇水淋洗，此方法NP的回收率為59.6%～64.4%，OP和APEOs的回收率為84.4%～104.4%，RSD為1.0%～13.5%。水基質(zhì)中的NP和OP還可以用二氯甲烷/正己烷(4∶1，V/V)或MTBE/甲醇(1∶1，V/V)混合萃取后，經(jīng)HLB固相萃取柱富集后分析檢測[26-27]。固相萃取法可富集凈化復(fù)雜固態(tài)基質(zhì)和液態(tài)基質(zhì)中的APs和APEOs，可檢測范圍較廣，此方法的缺點是萃取的容量低且容易阻塞固相萃取柱。

1.1.6 QuEChERS法

QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)是近年來國際上比較流行的一種農(nóng)產(chǎn)品檢測快速前處理技術(shù)。該方法的原理是利用吸附劑填料吸附基質(zhì)中的雜質(zhì)，達(dá)到凈化的目的。Chen等[28]用乙腈提取蜂蜜、花粉和蜂蠟中的APEO3-13，1 mL提取液經(jīng)150 mg MgSO4，150 mg PSA和50 mg C18凈化后，回收率為75%～111%，RSD<9%。Jiang等[29]用QuEChERS法凈化卷心菜，生菜和菠菜樣品中APEO2-20，該方法的回收率為72.8%～122.6%，RSD≤18.3%。QuEChERS法操作簡單、所需有機溶劑量少，可有效節(jié)約實驗成本，且此方法回收率高可檢測固態(tài)基質(zhì)中不同聚合度的APEOs。

綜上所述，上述幾種前處理提取方法中，索氏提取法花費時間較長、溶劑需求量較大且操作復(fù)雜；液-液萃取法溶劑需求量也較大，且僅適用于液態(tài)基質(zhì)中目標(biāo)化合物的提??；微波萃取操作簡單、提取效率較高；超聲萃取適合提取APs和特定聚合度的APEOs；固相萃取法雖適用于提取多種復(fù)雜基質(zhì)中的APs和APEOs，但固相萃取柱也有容量低、易阻塞吸附劑的缺點；QuEChERS法回收率較高，可檢測較高聚合度的APEOs，適用于提取復(fù)雜基質(zhì)中的APEOs。

1.2 烷基酚聚氧乙烯醚及烷基酚的儀器分析方法

APEOs及APs的儀器分析方法主要是色譜法和質(zhì)譜法。其中普遍采用HPLC法、GC法、LC/MS法和GC/MS法(表2和表3)來分析測定各種基質(zhì)中的APEOs及其代謝產(chǎn)物的含量。

表3 固態(tài)基質(zhì)的分析方法

表2 液態(tài)基質(zhì)的分析方法

1.2.1 HPLC法

HPLC是一種具有廣泛適用領(lǐng)域的分離分析方法，由于其具有廣泛的選擇性、高體積流速、耗樣量較小、高靈敏度、良好的分離效能和不破壞原有樣品等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于各個學(xué)科領(lǐng)域。

黃芳等[10]采用高效液相色譜/核磁共振光譜法來測定紡織品及紡織助劑中APEOs，用外標(biāo)定量法，首先對流動相和檢測波長進(jìn)行選擇，接著用雙體系色譜進(jìn)行定性，最后再用核磁共振光譜進(jìn)行驗證。實驗結(jié)果表明：該方法可用于測定紡織品及紡織助劑中APEOs類化合物，并且能達(dá)到足夠的準(zhǔn)確度和檢測下限，方法可靠。

陳武炯[11]采用高效液相色譜/二極管陣列檢測器分別對紡織品中的APs和APEOs進(jìn)行檢測。對波長和流動相條件進(jìn)行篩選，最終確定最佳的儀器條件，該方法中OP、NP及OPEOs的線性范圍為5～100 μg·mL-1，NPEO的線性范圍為10～200 μg·mL-1，R2為0.998 3～0.999 8，檢測限為0.1～2 μg·mL-1。劉顯奎等[26]采用高效液相色譜/二極管陣列檢測器對皮革中的APEOs進(jìn)行檢測，對波長、流動相、萃取方式、萃取時間和萃取溫度進(jìn)行了條件篩選，最終確定運用甲醇超聲60 min萃取結(jié)果最佳，方法回收率為86%～110%，RSD為2.9%～3.2%，OPEOs和NPEOs檢出限為3.4 mg·kg-1和3.7 mg·kg-1。高效液相色譜/二極管陣列檢測器可對APEOs進(jìn)行定量分析。

Cheng等[13]選取臺灣當(dāng)?shù)卮笮统兄械募邢礈靹┖拖匆路?，先溶于甲醇后過膜，采用HPLC/FLD檢測其中NPEOs的含量，得到41%的洗滌劑中均含有不同濃度的NPEOs，后來又用LC/MSI/MS進(jìn)行驗證其含量，得出該方法可以檢測NPEOs的含量。Li等[14]同樣采用HPLC/FLD方法檢測河水中的NP和OP的含量，前處理方法中添加了BCEC-Cl進(jìn)行衍生化，從而增加了分析物的疏水性、靈敏性，減小了雜質(zhì)干擾，該方法回收率為82%～92%，RSD為6.4%～8.8%，LOD為0.03 μg·L-1，LOQ為0.1 μg·L-1。Lou等[15]采用新型固相萃取柱進(jìn)行萃取、用HPLC/FLD分析檢測地表水中的NP，線性范圍為10～200 μg·L-1，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，LOD和LOQ分別為0.44 μg·L-1和1.47 μg·L-1。該方法提供了一種新的萃取方式，為今后的研究建立了基礎(chǔ)。

APEOs的分子量比較大，揮發(fā)性較差，比較適合用高效液相色譜進(jìn)行測定。然而用液相色譜檢測APEOs存在一些不足，即反相高效液相色譜不能區(qū)分不同聚合度的APEOs，而正相高效液相色譜不能區(qū)分同一聚合度的不同結(jié)構(gòu)，因此，目前很少使用單一的高效液相色譜來檢測APEOs及其代謝產(chǎn)物的含量，一般采取與質(zhì)譜或者其他檢測器聯(lián)用的方法來進(jìn)行檢測。

1.2.2 LC/MS法

LC/MS法具有靈敏度高、選擇性較好等優(yōu)點，用來分析測定APEOs，可對不同聚合度的APEOs定性和定量[30-38]。

Salgueiro-González等[39]利用LC/MS法檢測河水、飲用水和海水中的NP和OP，并且對MASE萃取方式的萃取參數(shù)(包含萃取劑、萃取溫度、萃取時間)進(jìn)行優(yōu)化，得到在正己烷、溫度為40 ℃、時間60 min時萃取效果最佳，接著比較了不同基質(zhì)對APs回收率檢測的影響，最后對該方法進(jìn)行了驗證。該方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合要求，從而得到應(yīng)用于水中APs的前處理和儀器分析的最佳方法。

蒲愛軍等[23]以甲醇為溶劑經(jīng)超聲波萃取、采用高效液相色譜/質(zhì)譜法來檢測紡織染整助劑產(chǎn)品中殘留的APEOs，并對色譜分析條件(包含流動相、色譜柱、柱溫以及監(jiān)測離子)和前處理條件(主要是萃取劑)進(jìn)行優(yōu)化，得出用甲醇萃取、流動相為甲醇/水=85/15、柱溫為40 ℃時，分離效果較好。

Chen等[28]用QuEChERS法結(jié)合UPLC/MS分析檢測了蜂蜜、花粉和蜂蠟中的OPEO3-13和NPEO3-13，NPEOs和OPEOs的平均檢測限分別為0.56 μg·kg-1和0.44 μg·kg-1，實際樣品中檢出NPEOs濃度為26～10 239 μg·kg-1。林琴[25]利用SPE法結(jié)合LC/MS分析茶葉基質(zhì)中的APEO3-20，該方法篩查出市售茶葉中的OPEO3-20和NPEO3-20的含量范圍分別為0.03～12.9 μg·kg-1和0.3～215.9 μg·kg-1，而市售茶飲料中APEOs的含量則均低于LOQ。

另外王成云等[16]、王愛霞等[17]和王金成等[18]也通過LC/MS分別來檢測紡織品、內(nèi)墻涂料和海水中的APEOs。LC/MS法可有效應(yīng)用于定性定量分析測定多種基質(zhì)中的APEOs及其代謝產(chǎn)物，檢測方法簡便、快速、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定。

1.2.3 GC法

20世紀(jì)30年代，舒夫坦和尤肯發(fā)展了氣固色譜法。接著詹姆斯和馬丁提出氣液色譜法，而現(xiàn)在氣相色譜法有時主要指氣液色譜法。氣相色譜法主要應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、石油工業(yè)、藥物學(xué)、臨床化學(xué)和食品工業(yè)等。張洛紅等[12,40-43]和馮琳等[44]都建立毛細(xì)管內(nèi)固相萃取/氣相色譜檢測方法，用優(yōu)化后的毛細(xì)管固相萃取柱對APs進(jìn)行萃取后進(jìn)行氣相色譜檢測。該方法能夠?qū)pb級別殘留量的檢測。氣相色譜法具有檢測靈敏度高、分離效率高、選擇性和樣品用量少等優(yōu)點。而缺點是在定性、定量分析時，必須用已知物或已知數(shù)據(jù)比對和校正，因此，在同時檢測多種APEOs時并不適用。

1.2.4 GC/MS法

GC/MS法的研究開始于60年代，后來隨著80年代新的質(zhì)譜技術(shù)出現(xiàn)，越來越廣泛地被應(yīng)用。GC/MS是利用氣相色譜的分離能力和質(zhì)譜的鑒定能力達(dá)到對目標(biāo)分子定性定量的目的。GC/MS法適合分析測定分子量較小、揮發(fā)性較好的APs與短鏈APEOs，不適合聚合度較高的難揮發(fā)的APEOs。

蔡素婷等[20]和Li等[30]均采用GC/MS法分別對水和尿液中的短鏈APEOs進(jìn)行檢測。運用二氯甲烷、甲醇作為萃取劑，用液-液萃取、固相萃取來檢測。然而尿液中和飲用水中的NP含量明顯差異很大，Li等[30,45-47]通過兒童和成人的對比，并且研究運用塑料杯和陶瓷杯來飲用水情況下尿液中NP的含量，從而對兒童健康和日常飲食提出了寶貴建議。相關(guān)研究為GC/MS對短鏈APEOs檢測提供了范例，也為今后進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

GC/MS法可以同時定性、定量檢測，優(yōu)點是分辨率較高、分離效率高、選擇性比較好和檢測速度快[48]。但運用GC/MS法檢測APEOs時，由于其揮發(fā)性較差，用氣相色譜質(zhì)譜測定之前必須進(jìn)行衍生化反應(yīng)，衍生化時間甚至長達(dá)12 h[19]，前處理過程耗時長、操作較繁瑣，并且GC/MS分析對象局限于APs和APEO1-2，因此，目前該方法并不能廣泛運用。

2 小結(jié)與展望

目前色譜類分析方法已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，是檢測APEOs及其代謝產(chǎn)物的重要手段。以往的研究中主要是針對紡織品和水中的APEOs和APs的檢測，并且不同方法之間的差異較大，單一的色譜法往往檢測限比較高，并不適合濃度較低的基質(zhì)中的痕量檢測，而且不能準(zhǔn)確地定量檢測。因此，色譜與其他檢測器聯(lián)用是分析檢測APEOs和APs的常規(guī)方法，其中使用較多的是色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。相對于單一的色譜法，色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法具備簡便、快速、靈敏度高、定性定量效果好等優(yōu)點。但其缺點是分析和檢測受場地限制，無法在現(xiàn)場進(jìn)行快速檢測。

因此，優(yōu)化和改進(jìn)不同基質(zhì)中APEOs和APs的分析檢測方法是勢在必行的。首先，需要優(yōu)化前處理步驟和儀器檢測條件，使得色譜類分析方法操作更加簡便。簡化操作方法，才能節(jié)約時間和成本。其次，開發(fā)其他基質(zhì)如農(nóng)藥、植物基質(zhì)和動物基質(zhì)等的分析檢測方法。目的是簡化現(xiàn)有方法的同時，拓寬可檢測范圍。最后，還可以開發(fā)一些新的方法如生物學(xué)方法，快速檢測試劑盒等來檢測APEOs和APs，開發(fā)便攜的、能超快速檢測的儀器和其他類新的方法也是今后的發(fā)展趨勢之一。