李朝陽，羅武，楊凱，邵勇鋼，翟曼君，董新星，韋偉，陳杰，張立凡*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095;2. 新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆 烏魯木齊 830052;3. 云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201)

豬遺傳資源保護研究主要通過采集豬的血液或耳組織等樣本來獲得個體的DNA，這些方法具有操作簡便，提取出的DNA樣品質量較好等優(yōu)點。然而，采集豬的血液或組織或多或少都會傷害到動物的健康，不利于動物福利。另外，對于一些珍貴且種群數(shù)量較少的豬遺傳資源，反復采集其血液或組織樣本也對豬本身的傷害較大。因此，開發(fā)豬無損傷DNA獲取方法不但可以提升豬的福利水平，減輕采集過程對個體生長發(fā)育的影響，節(jié)省人力成本，同時也將會為豬的各類研究，DNA基因組樣本規(guī)?；占约艾F(xiàn)今新的分子選育技術(如基因組選擇)提供巨大的技術支撐。

過去的數(shù)十年里，人們對于豬無損傷DNA獲取方法也進行了很多探索，最為典型的是從豬的毛發(fā)中提取DNA樣品。印崇等[1]研究了5個豬種不同數(shù)量毛發(fā)提取DNA的效果，結果顯示毛發(fā)提取出來的DNA主要在毛囊部位，毛干幾乎沒有提取出DNA，這也意味著需要從豬身上拔去包含毛囊的完整毛發(fā)，造成在實際操作過程中尤其是對成年豬進行毛發(fā)收集時增加了采集難度。因此從豬的毛發(fā)中提取DNA樣品鮮有規(guī)?；膶嶋H應用。

因此，本研究首次嘗試和開發(fā)了從豬的唾液中獲取DNA的方法，此方法可以有效避免采集樣本時對動物本身造成傷害，從而改變了以往從耳組織和血液獲取DNA的現(xiàn)狀，同時提升實驗動物的福利水平，減輕試驗本身對動物生長發(fā)育的影響[7]。本研究對于提升豬的福利水平、群體遺傳研究以及我國珍稀地方豬種遺傳資源的DNA樣品獲取都具有非常重要的應用價值。

1 材料與方法

1.1 采樣動物

以常州市焦溪二花臉豬合作社的二花臉豬為對象，分別采集5頭二花臉公仔豬(15日齡)和成年公豬(180日齡)的唾液，以及5頭采集過唾液的成年公豬屠宰后的背最長肌肌肉為對照提取樣品。

1.2 唾液采集方法

唾液采集方法一：醫(yī)用棉簽。先將仔豬固定好，采用多根康每樂10 cm長度的醫(yī)用棉簽放入仔豬的口腔中，棉簽與舌頭以及口腔上皮擦拭2 min后取出，放入凍存管，標記后低溫下保存。

唾液采集方法二：自制海綿采樣工具(圖1)。自制約5 cm×3 cm×1 cm大小的海綿塊，在中線的1/3處開孔。采集桿為塑料材質，長度較長，可以防止采集過程中被動物咬傷。采集工具的前端為夾子狀，前端1/4處的卡口用于夾緊海綿。采集時將海綿采集工具伸到豬的面前，吸引豬上前并咬住采集工具，咀嚼海綿。前后咬2 min左右時海綿完全濕潤即可完成采集。再將海綿取下并放入自封袋，進行標記和密封，清洗采集工具并換上新的海綿。采集的海綿放在低溫下保存。

圖1 唾液采樣工具

1.3 試驗試劑及儀器

主要試劑：組織裂解液，由十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tris、EDTA和NaCl溶液混合配制；高保真DNA聚合酶，DNA Marker，DNA Loading buffer，TS-GelRed 核酸凝膠染料，瓊脂糖，10×TBE溶液，購自北京擎科生物科技有限公司。主要儀器：高速離心機(德國艾本德股份公司)和NanoDrop 2000分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.4 豬唾液DNA提取

1.4.1 裂解法提取豬唾液DNA

將含有唾液的棉簽和海綿取下，并放入裝有DEPC水的采集管中，完全浸沒約2 h后11 000 r/min離心10 min，獲得唾液沉淀物；將唾液沉淀物置于2 mL離心管中，加入800 μL組織裂解液和20 μL蛋白酶K溶液，放入水浴鍋內55 ℃放置2 h；加入約800 μL飽和酚，在搖勻器上搖勻10 min，11 000 r/min離心10 min；取上清液置于新的2 mL離心管中，加入500 μL飽和酚和500 μL氯仿異戊醇溶液，搖勻10 min，11 000 r/min離心10 min；取上清液置于新的2 mL管，加入1 000 μL氯仿溶液，搖勻10 min，11 000 r/min離心10 min；取上清液置于新的1.5 mL管中，加800 μL低溫處理過的無水乙醇，搖勻10 min，11 000 r/min離心10 min；棄去管中液體，在沉淀里加70%乙醇清洗后吸干液體，放置于通風櫥內；干燥后加入50 μL TE溶液，溶解DNA；提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時檢測其OD260/OD280和OD260/OD230值以獲取DNA樣品的濃度和純度。

1.4.2 碘化鉀方法提取唾液DNA

參考文獻[8]對采集的唾液樣本進行DNA提取。對照組肌肉組織樣品采用經(jīng)典酚仿法提取DNA。

1.5 基因組DNA體外PCR擴增

以不同方法從唾液和肌肉組織樣品中提取的DNA作為模板，選取豬的持家基因GAPDH作為擴增目的基因，按照高保真酶試劑盒要求配制PCR反應體系，接著在PCR擴增儀上進行擴增，之后采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

PCR反應體系為25 μL：DNA模板鏈1 μL，引物F和R均為1 μL，ddH2O為9.5 μL，高保真酶為12.5 μL。GAPDH基因引物為，F(xiàn)：5′-ACGTGTCGGTTGTGGATCTG-3′，R：5′-CAGGGGGCACCAGA-CTTGAT-3′。PCR循環(huán)參數(shù)為: 98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，循環(huán)35次；72 ℃ 5 min。引物設計的PCR擴增產(chǎn)物大小為462 bp。

1.6 PCR產(chǎn)物測序及序列比對

擴增結束后將PCR產(chǎn)物送到南京擎科生物科技有限公司進行測序，測序結果通過DNAMAN軟件的多序列對比工具進行比對和分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，DNA純度和濃度比較采用單因子方差分析法，多重比較使用Tukey法，數(shù)據(jù)采用“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 不同裂解液體積對豬唾液基因組DNA的提取效果比較

如表1所示，不同的裂解液體積對唾液DNA質量的影響主要表現(xiàn)在DNA濃度和OD260/OD230比值上，裂解液量在800 μL時獲得的DNA量最多。不同量的裂解液對OD260/OD280影響不明顯，OD260/OD230值在裂解液量達到600 μL時基本不會提升，因此得出裂解液最佳使用量是800 μL。

表1 不同裂解液體積獲得的DNA濃度和純度對比(n=2)

2.2 唾液基因組DNA的得率和純度比較

從表2可以看出，仔豬、成年公豬的唾液與肌肉樣品中獲取的DNA濃度相近(P>0.05)，但不同個體間存在差異。來源于肌肉樣品DNA的OD260/OD280值平均在1.95左右，和仔豬唾液DNA的OD260/OD280值相差不大。仔豬唾液DNA的OD260/OD280和OD260/OD230值好于成年公豬。碘化鉀方法從唾液中獲取的DNA濃度和OD260/OD230值顯著低于裂解法(P<0.05)。

表2 不同方法提取的DNA濃度和純度表(n=5)

2.3 唾液DNA的電泳檢測

從圖2中可以看出從唾液和肌肉組織樣品中獲得的DNA條帶亮度較高且相差不大，前15個樣品均有較為完整的DNA條帶，圖中無明顯雜帶，說明DNA降解現(xiàn)象較少發(fā)生。泳道16～20為碘化鉀法提取的DNA條帶，其亮度模糊偏暗并有很明顯的雜質存在。

2.4 唾液基因組DNA的PCR擴增

由圖3可以看出PCR產(chǎn)物均為單一條帶，位于500 bp條帶下方，與設計的462 bp長度相符合，其中仔豬和成年豬唾液提取的DNA擴增產(chǎn)物的熒光條帶亮度較高，并且與肌肉組織的DNA擴增產(chǎn)物相比亮度差異不大。碘化鉀法提取的成年公豬唾液DNA條帶較暗，說明碘化鉀法可以從唾液中獲得二花臉豬DNA，但由于DNA本身濃度低，擴增效果不好。

1～5.裂解法提取的仔豬唾液的DNA;6～10.裂解法提取的成年豬唾液的DNA;11～15.裂解法提取的成年豬肌肉組織的DNA;16～20.碘化鉀法提取成年豬唾液的DNA

M. DL2000 DNA Marker;1～5.裂解法提取的仔豬唾液的DNA擴增產(chǎn)物;6～10.裂解法提取的成年豬唾液的DNA擴增產(chǎn)物;11～15.裂解法提取的成年豬肌肉組織的DNA擴增產(chǎn)物;NC.不加模板DNA的陰性對照組;16～20.用碘化鉀法提取成年豬唾液的DNA擴增產(chǎn)物

2.5 測序結果比對

對上述擴增出GAPDH基因的PCR產(chǎn)物進行測序，結果發(fā)現(xiàn)15個DNA的PCR產(chǎn)物測序結果與原GAPDH序列幾乎一致，一致性為95.94%(圖4)。

B1～B5.裂解法提取的成年豬唾液DNA擴增產(chǎn)物;J1～J5.裂解法提取的成年豬肌肉DNA擴增產(chǎn)物;S1～S5.裂解法提取的仔豬唾液DNA擴增產(chǎn)物;GAPDH. 設計的模版序列

3 討論

通過采集動物的唾液并從中提取出DNA是一種方便且不以損傷動物健康為代價的DNA獲取方法，理論上可以應用于所有能夠分泌唾液的哺乳動物，然而對于不同的動物，其采集與提取方式也不盡相同。Lobo等[9]曾經(jīng)用軟木塞、聚苯乙烯泡沫和木塊結合食物誘餌采集狗的唾液，發(fā)現(xiàn)通過聚苯乙烯泡沫采集到的唾液量最多。Subharat等[10]采用棉簽來收集綿羊的唾液。本試驗先從采集唾液最為容易的仔豬開始研究唾液的采集方法。生活中醫(yī)用棉簽是最為常用的樣品采集工具，由于仔豬容易固定，醫(yī)用棉簽采集相對安全，因此對仔豬的唾液采集使用了醫(yī)用棉簽。成年豬體型和力量較大，難以固定，棉簽采集唾液容易被咬斷，因此自制海綿采集工具。此工具可以通過海綿來收集豬的唾液，同時較長的桿柄可以保持采樣者與豬個體間的距離，采集過程中海綿會與口腔表面和舌頭進行摩擦使得更多的口腔細胞附著于海綿上，從而采集到足夠量的唾液和細胞。結果發(fā)現(xiàn)2種采集方法都可以收集到豬的唾液并提取出基因組DNA。盡管海綿采集工具獲得的唾液量和雜質比棉簽多，但比對2種方法提取的DNA濃度和純度上沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。

在人類醫(yī)學上對唾液進行采集和提取DNA的研究已經(jīng)相對成熟，比如李子怡等[11]探究了Chelex100法提取口腔黏膜細胞DNA的效果；孫佳蕊等[12]采用煮沸法和堿裂解法從人的口腔黏膜上皮細胞提取DNA，發(fā)現(xiàn)堿裂解法提取的濃度優(yōu)于煮沸法；Nemoda等[13]探討了不同介質如海綿、棉簽、脫脂棉以及直接采集唾液的效果。本研究主要參考了楊澤民等[8]的碘化鉀提取唾液DNA的方法，同時也對組織裂解法進行了改進。結果發(fā)現(xiàn)碘化鉀法相對簡單，DNA的提取耗時短，但是獲得的DNA純度較低，其OD260/OD230值低于0.5。一般而言，DNA的OD260/OD230值低于1.6說明提取出的DNA中含有較多的鹽離子、糖類物質。相對于碘化鉀法，裂解法步驟較多，但無論是濃度還是純度，裂解法都比碘化鉀法提取效果好，并且與豬肌肉中提取的DNA質量接近。結合DNA凝膠電泳和PCR產(chǎn)物測序檢測，發(fā)現(xiàn)此方法可以成功地獲得合格的豬唾液基因組DNA，其質量完全可以用于基因擴增等分子生物學研究。

此外，我們發(fā)現(xiàn)成年公豬和仔豬唾液提取的DNA濃度、OD260/OD280和OD260/OD230值，以及PCR產(chǎn)物都沒有明顯的差別，這也說明盡管成年公豬和仔豬口腔里的唾液量和雜質量各不相同，但并沒有影響唾液提取的DNA質量。

雖然從豬唾液中提取DNA的優(yōu)點很多，但也存在一些問題。從唾液中提取的DNA可能還會含有細菌等其他生物的DNA，因此在進行豬唾液樣品采集時除了多給動物飲水之外，還需要更多的有效措施來清潔個體的口腔。