丁佰韜，王琦，崇金星，陳暢，楊平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

中華鱉，又名甲魚，是一種古老的爬行類動(dòng)物，也是我國養(yǎng)殖規(guī)模最大的爬行動(dòng)物之一，鱉肉肥美鮮嫩，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，鱉甲常用作中藥材，具有極高的醫(yī)用和藥用價(jià)值[1]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)中華鱉生殖特性的研究發(fā)現(xiàn)，中華鱉精子發(fā)生的季節(jié)性變化具有階段性和過程特異性[2]。中華鱉是一種季節(jié)性繁殖動(dòng)物，4～5年齡性成熟，精子發(fā)生開始于春季5月初，持續(xù)到秋季末，在冬季11月初精子一次性地被釋放到附睪后，進(jìn)入冬眠期，此時(shí)動(dòng)物機(jī)體的體溫、代謝等生理活動(dòng)下降[3]，精子發(fā)生也進(jìn)入停滯期；到春季，中華鱉各項(xiàng)生理活動(dòng)緩慢復(fù)蘇，生殖活動(dòng)也進(jìn)入精子發(fā)生初期，并在夏季達(dá)到精子發(fā)生的高峰期[4]。

界膜也被稱為固有層、管周層、管周組織或邊界組織[5]。它由最外層的成纖維細(xì)胞、中間的肌樣成纖維細(xì)胞和最內(nèi)層的細(xì)胞外基質(zhì)組成。成纖維細(xì)胞可分泌一定的基質(zhì)和纖維，以修復(fù)睪丸界膜。中層的肌樣成纖維細(xì)胞有平滑肌細(xì)胞收縮的特性，以調(diào)節(jié)生精小管的壓力，促進(jìn)精子向附睪方向移動(dòng)[6]，因此，肌樣成纖維細(xì)胞可以表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)；肌樣成纖維細(xì)胞還具有成纖維細(xì)胞的特性，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，影響支持細(xì)胞代謝，在睪丸間質(zhì)細(xì)胞之間形成微循環(huán)；在病理狀態(tài)下，肌樣成纖維細(xì)胞還能夠向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，以分泌基質(zhì)和纖維。最內(nèi)層的基質(zhì)部分位于基膜和細(xì)胞之間，支持細(xì)胞和肌樣成纖維細(xì)胞分泌的多種蛋白都在其中發(fā)揮生理學(xué)作用[7]。

目前關(guān)于睪丸的研究多聚焦于哺乳動(dòng)物，如小鼠、人類等[2, 5-13]。對(duì)于爬行動(dòng)物睪丸的研究較少，尤其是中華鱉睪丸界膜的季節(jié)性變化。本試驗(yàn)選用不同繁殖階段的中華鱉睪丸，采用HE染色、馬松染色、甲苯胺藍(lán)染色、免疫組化染色方法研究中華鱉睪丸界膜的季節(jié)性變化，為中華鱉睪丸界膜的深入研究，促進(jìn)中華鱉常年繁殖的潛在應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別于2019年4月、12月，于南京水產(chǎn)市場采購5只成熟健康中華鱉，750～950 g/只。

1.2 光鏡樣品制備

將睪丸切割為小塊組織，置于4%多聚甲醛固定48 h，上行梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，用萊卡切片機(jī)RM2455(Leica公司)制作石蠟切片(厚度5 μm)。

1.3 HE染色

蘇木精染色1 min，伊紅染色10 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡DP73(Olympus公司)觀察中華鱉睪丸形態(tài)變化并拍照。

1.4 馬松染色

用Weigert鐵蘇木素染色液染色5～10 min，酸性乙醇分化液分化5～15 s，水洗后馬松藍(lán)化液返藍(lán)3～5 min，水洗后麗春紅品紅染色液染色5～10 min，磷鉬酸溶液洗1～2 min，再用配置好的弱酸工作液洗1 min，放入苯胺藍(lán)染液中染色1～2 min，弱酸工作液洗1 min，95%乙醇快速脫水，無水乙醇脫水3次，每次5～10 s，二甲苯透明3次，每次1～2 min，中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡DP73(Olympus公司)觀察中華鱉睪丸結(jié)締組織變化并拍照。

1.5 甲苯胺藍(lán)染色

睪丸切片入甲苯胺藍(lán)染液5 min，水洗，1%的冰醋酸分化，自來水洗終止反應(yīng)，顯微鏡下控制分化程度，自來水洗后，將切片置于烤箱烤干。二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡DP73(Olympus公司)觀察中華鱉睪丸界膜內(nèi)肥大細(xì)胞變化并拍照。

1.6 免疫組化染色觀察

3% H2O2室溫孵育10 min除去內(nèi)源性過氧化物酶。0.02 mol/L PBS清洗5 min×3次，切片上滴加5% BSA室溫孵育30 min。擦拭切片周圍，用0.01 mol/L PBS溶液以1∶50的濃度稀釋一抗并滴加α-SMA抗體(BM00022，武漢博士德生物公司)，4 ℃孵育過夜。次日，切片用0.02 mol/L PBS漂洗5 min×3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗(即用型快捷免疫組化試劑盒Kit-5001，福州邁新生物公司)，將切片放入濕盒中37 ℃孵育60 min，用0.02 mol/L PBS漂洗5 min×3次，滴加SABC復(fù)合物，37 ℃孵育30 min，0.02 mol/L的PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色8 min，蒸餾水洗5 min×3次，蘇木精復(fù)染10 s，中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡DP73(Olympus公司)觀察中華鱉睪丸界膜內(nèi)肌樣成纖維細(xì)胞變化并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

隨機(jī)選取相同倍鏡下的HE圖片，使用ImageJ Pro測量圖片積分光密度值(IOD值)，分析得到不同繁殖階段中華鱉睪丸生精小管面積、生精上皮厚度、界膜面積、界膜厚度數(shù)據(jù)。使用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)比較不同繁殖階段中華鱉睪丸生精小管面積、生精上皮厚度、界膜面積、界膜厚度的差異，用GraphPad Prism 5.0作圖，所得數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華鱉睪丸形態(tài)學(xué)比較

通過HE染色觀察到，冬眠期中華鱉睪丸生精小管管腔內(nèi)的生精上皮由2～3層生精細(xì)胞構(gòu)成，但生精細(xì)胞數(shù)量較少，初級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞甚至消失，偶爾能看見生精小管管腔內(nèi)有殘存的上個(gè)生精周期的精子細(xì)胞(圖1A)。生精小管管腔在冬眠期出現(xiàn)明顯皺縮(圖1A、圖1B)，生精小管界膜內(nèi)廣泛分布血管、淋巴管及各種形態(tài)的細(xì)胞(圖1A)，血管多圍繞在生精小管周圍(圖1B)。界膜內(nèi)不僅可見各種形態(tài)的細(xì)胞，還有緊貼在生精小管界膜的梭形細(xì)胞，以及存在于生精小管之間的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，睪丸間質(zhì)細(xì)胞呈圓形或多邊形，細(xì)胞質(zhì)呈嗜酸性，常圍繞血管周圍(圖1B)。

繁殖期中華鱉睪丸生精小管擁有明顯擴(kuò)張的管腔，管壁內(nèi)襯5～8層生殖細(xì)胞的生精上皮，并形成從基底部開始向管腔部發(fā)出的放射狀排列的精子柱。精子柱上排列著各級(jí)生精細(xì)胞(圖1C、圖1D)。繁殖期中華鱉睪丸生精小管周圍血管變少，界膜厚度變薄(圖1C)，在結(jié)締組織內(nèi)可見精子細(xì)胞(圖1D)。

A.冬眠期鱉睪丸生精小管出現(xiàn)皺縮；B.冬眠期鱉睪丸生精小管周圍血管、淋巴管較多；C.繁殖期鱉睪丸生精小管管腔擴(kuò)張；D.繁殖期鱉睪丸界膜存在游離精子。ST.生精小管；BV.血管；LC.睪丸間質(zhì)細(xì)胞；→.精子細(xì)胞

通過馬松染色觀察到，冬眠期生精小管之間以界膜隔開，界膜外存在大量膠原纖維，包圍生精小管，并將生精小管與外部分隔開，膠原纖維內(nèi)存在深染的細(xì)胞成分(圖2A、2B)。繁殖期中華鱉睪丸間質(zhì)內(nèi)多是膠原纖維，且膠原纖維稀疏，細(xì)胞成分較冬眠期少(圖2C、2D)，生精小管之間通過血管、結(jié)締組織等連接。

通過甲苯胺藍(lán)染色可清晰觀察中華鱉睪丸界膜內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)。冬眠期時(shí)，膠原纖維淡染，可見大量的細(xì)胞成分，此時(shí)睪丸生精小管周圍包繞多層肌樣成纖維細(xì)胞細(xì)胞，通過甲苯胺藍(lán)染色難見肥大細(xì)胞存在(圖3A、3B)，但界膜分布有細(xì)長梭形狀核的肌樣成纖維細(xì)胞。繁殖期時(shí)，細(xì)胞成分減少，但生精小管基底部可見形態(tài)不同于冬眠期睪丸界膜的肌樣成纖維細(xì)胞，此時(shí)肌樣成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核細(xì)長，胞體較大，有突起，分布于睪丸間質(zhì)細(xì)胞周圍，且光鏡下分層不明顯，此時(shí)肥大細(xì)胞仍難以見到(圖3C、3D)。

A.冬眠期鱉睪丸疏松結(jié)締組織包繞生精小管；B.冬眠期鱉睪丸界膜膠原纖維豐富；C.繁殖期鱉睪丸疏松結(jié)締組織分布稀疏；D.繁殖期鱉睪丸膠原纖維內(nèi)分布血管。ST.生精小管；BV.血管；CF.膠原纖維

A.冬眠期鱉睪丸膠原纖維淡染；B.冬眠期鱉睪丸生精小管外側(cè)有多層肌樣成纖維細(xì)胞；C.繁殖期鱉睪丸細(xì)胞成分較少；D.繁殖期鱉睪丸僅可見單層肌樣成纖維細(xì)胞?！?肌樣成纖維細(xì)胞

2.2 中華睪丸生精小管及界膜的面積及厚度比較

繁殖期中華鱉睪丸生精小管面積顯著大于冬眠期(P<0.05，圖4A)，生精上皮厚度極顯著大于冬眠期(P<0.01，圖4B)；冬眠期中華鱉睪丸界膜面積顯著大于繁殖期(P<0.05，圖4C)，界膜厚度極顯著大于冬眠期(P<0.01，圖4D)。從冬眠期到繁殖期，中華鱉睪丸生精小管面積增加，生精上皮厚度同樣增加；界膜面積減少，界膜厚度同樣減小。

A.不同繁殖階段生精小管面積比較；B. 不同繁殖階段生精上皮厚度比較；C.不同繁殖階段界膜面積比較；D.不同繁殖階段界膜厚度比較。*P<0.05表示差異顯著；** P<0.01表示差異極顯著

2.3 中華鱉睪丸肌樣成纖維細(xì)胞變化比較

為進(jìn)一步探究生精小管周圍梭形細(xì)胞的分布與表達(dá)，使用α-SMA定位肌樣成纖維細(xì)胞，其在不同月份的中華鱉睪丸表達(dá)定位也不相同。在冬眠期的中華鱉睪丸組里，α-SMA表達(dá)的肌樣成纖維細(xì)胞在生精小管周圍廣泛呈彌散狀，其細(xì)胞核細(xì)長，形成3～4層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包繞生精小管(圖5A、5B)。在繁殖期中華鱉睪丸中，生精上皮管腔內(nèi)仍排列著大量的游離精子，管腔基底部排列著發(fā)育中的生殖細(xì)胞和永久性的支持細(xì)胞(圖5C)。α-SMA仍然在生精小管周圍的界膜表達(dá)，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包繞生精小管，也在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中少量表達(dá)，此時(shí)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育充分，環(huán)繞在肌樣成纖維細(xì)胞周圍。肌樣成纖維細(xì)胞緊貼生精上皮表達(dá)，胞核細(xì)長，胞質(zhì)呈長突起狀(圖5D)。

3 討論

本試驗(yàn)采用HE染色、馬松染色、甲苯胺藍(lán)染色以及免疫組化試驗(yàn)對(duì)中華鱉睪丸界膜進(jìn)行了分析。界膜是構(gòu)成睪丸微環(huán)境的結(jié)構(gòu)，能夠調(diào)節(jié)精子的正常發(fā)生，也被人稱為固有層、管周組織等[5]。界膜對(duì)于睪丸實(shí)質(zhì)的物質(zhì)交換起著重要作用，營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物都需要先通過界膜才能出入生精上皮。有研究認(rèn)為界膜的內(nèi)外層細(xì)胞皆具有物質(zhì)運(yùn)輸功能，其中肌樣成纖維細(xì)胞含有大量的吞飲小泡[8]。生精小管界膜能夠有選擇性地選擇物質(zhì)通過。促卵泡激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、類固醇激素、水和葡萄糖較易通過，肌醇、氨基酸、蔗糖等則需要較長的通過時(shí)間，還有些物質(zhì)則完全不可以通過。因此，有研究認(rèn)為界膜是血-睪屏障的一部分[12]。

A.冬眠期鱉睪丸肌樣成纖維細(xì)胞呈彌散狀；B.冬眠期鱉睪丸肌樣成纖維細(xì)胞的胞核及突起；C.繁殖期鱉睪丸成纖維細(xì)胞環(huán)繞生精小管；D.繁殖期鱉睪丸成纖維細(xì)胞連接生精小管和睪丸間質(zhì)細(xì)胞。ST.生精小管；BV.血管；LC.睪丸間質(zhì)細(xì)胞；→.肌樣成纖維細(xì)胞細(xì)胞核；.肌樣成纖維細(xì)胞突起；.多層的肌樣成纖維細(xì)胞彌散分布；.血管平滑肌細(xì)胞

界膜的基膜和細(xì)胞之間的成分被稱為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，ECM能夠調(diào)控支持細(xì)胞的分化、代謝活動(dòng)，維持支持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能[9]。肌樣成纖維細(xì)胞的分泌物是構(gòu)成ECM的重要組分，如纖維連接蛋白、膠原纖維和生長因子等[14]，其中一些物質(zhì)會(huì)影響支持細(xì)胞的功能[10]。如肌樣成纖維細(xì)胞可參與維生素A的加工[15]。因此，肌樣成纖維細(xì)胞能通過改變ECM的成分以調(diào)節(jié)支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。因此，肌樣成纖維細(xì)胞不僅為生精小管提供結(jié)構(gòu)完整性，還參與精子發(fā)生和調(diào)節(jié)睪丸功能。

人們首先在哺乳動(dòng)物物種中發(fā)現(xiàn)了圍繞睪丸生精小管的肌樣成纖維細(xì)胞，它們組成曲細(xì)精管的外細(xì)胞層，并與Sertoli細(xì)胞的基底面直接接觸[6]。但它們?cè)谏」荛g質(zhì)組織中的形態(tài)因物種而異。在嚙齒動(dòng)物中，包括大鼠、倉鼠和小鼠，在睪丸中僅見到一層肌樣成纖維細(xì)胞，細(xì)胞之間由不同的結(jié)構(gòu)連接。在人和一些其他動(dòng)物的生精小管界膜中存在多層的肌樣成纖維細(xì)胞[11]。這種由肌樣成纖維細(xì)胞形成的邊界組織有助于將生精小管與間質(zhì)分開。

本研究在中華鱉的睪丸中觀察研究肌樣成纖維細(xì)胞的季節(jié)性變化。在冬眠期睪丸中，生精小管外存在類似人類睪丸的多層肌樣成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞表達(dá)SMA。而在繁殖期的睪丸中，肌樣成纖維細(xì)胞分層不明顯，且不呈冬眠期狀態(tài)的彌散式分布。這可能與肌樣成纖維細(xì)胞影響睪丸精子的運(yùn)輸有關(guān)[16]。一方面，肌樣成纖維細(xì)胞可以與其他細(xì)胞協(xié)同精子發(fā)生[17]；另一方面，ECM的沉積和肌樣成纖維細(xì)胞的形態(tài)變化可能會(huì)導(dǎo)致雄性動(dòng)物的不育癥[18]。因此，深入了解肌樣成纖維細(xì)胞在精子發(fā)生中的作用和調(diào)控機(jī)制，對(duì)于研究雄性不育癥具有重要意義。

同時(shí)，在睪丸疏松結(jié)締組織中，肥大細(xì)胞是一種常見的細(xì)胞類型，常沿淋巴管和小血管分布，在身體易于接觸外界抗原的地方，肥大細(xì)胞分布廣泛。在不同物種中，肥大細(xì)胞的數(shù)量也不一樣，在馬、豬和人睪丸中常發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞；相反，兔睪丸內(nèi)缺乏肥大細(xì)胞。另外，還有一些物種如大鼠、犬、貓、牛和鹿的睪丸實(shí)質(zhì)中沒有肥大細(xì)胞[10]。

在人睪丸中，肥大細(xì)胞的數(shù)量隨著年齡改變而改變。嬰兒期睪丸間質(zhì)中的肥大細(xì)胞略有增加，但在兒童期減少，到了青春期增加明顯，成年后睪丸結(jié)締組織中肥大細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，這種數(shù)量的變化可能與睪丸結(jié)締組織發(fā)育的變化有關(guān)[19]。在中華鱉睪丸中，巨噬細(xì)胞的分布與人類或大鼠睪丸區(qū)別明顯。肥大細(xì)胞在不同物種的分布差異還有待進(jìn)一步研究。

冬眠期鱉睪丸界膜厚度和繁殖期界膜厚度存在顯著性差異，冬眠期中華鱉睪丸界膜厚度要極顯著大于繁殖期中華鱉睪丸，這種界膜厚度的變化在哺乳動(dòng)物不育癥和正常生殖組中也有同樣的表現(xiàn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，患生精障礙的人群中，精子發(fā)生的嚴(yán)重降低常伴隨生精小管界膜增厚，在人類生精小管界膜中，結(jié)締組織基質(zhì)成分的異常擴(kuò)張是導(dǎo)致生精小管增厚的主要原因[13]。有研究顯示，生精功能嚴(yán)重減退的證據(jù)是減退患者睪丸結(jié)蛋白樣免疫反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量和強(qiáng)度明顯減少，這是肌樣成纖維細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的表現(xiàn)[5]。而人和中華鱉睪丸具有相同結(jié)構(gòu)的肌樣成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)以及季節(jié)性變化可能為研究生精障礙提供了潛在病理模型。

綜上，本研究通過組織學(xué)觀察和形態(tài)計(jì)量學(xué)分析，對(duì)不同繁殖階段的中華鱉肌樣成纖維細(xì)胞和界膜形態(tài)進(jìn)行了研究，并觀察到一定的變化，這種變化可能與其不同的生理繁殖期有關(guān)，為深入研究中華鱉繁殖機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。