陳佳靜，李彤彤，張則，盧安然，李陳飛，馮秀麗

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部“動(dòng)物健康與食品安全”國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

法氏囊是禽類(lèi)中樞體液免疫器官。法氏囊源活性分子發(fā)揮了多種功能，如免疫調(diào)節(jié)[1-3]、促進(jìn)B細(xì)胞分化[4-5]、抗氧化[6]及抗腫瘤[7-8]等功能。前期研究發(fā)現(xiàn)，法氏囊源活性分子法氏囊五肽(BPP-I、BPP-IV)來(lái)源于同一種蛋白分子，即Cbl(Casitas b-lineage lymphoma)[9]。Cbl蛋白家族是具有Ring Finger結(jié)構(gòu)域的一種泛素化激酶(E3)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在3種Cbl亞型，分別為c-Cbl，Cbl-b和Cbl-3[10]。Cbl-b蛋白可以通過(guò)充當(dāng)銜接蛋白來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞活化。在免疫系統(tǒng)中，Cbl-b可通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞，B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)激活途徑在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。Cbl編碼906個(gè)氨基酸的多結(jié)構(gòu)域蛋白c-Cbl，其主要功能是調(diào)節(jié)酪氨酸激酶[12]。c-Cbl是一種120 kDa的蛋白質(zhì)，包含1個(gè)變異的SH2結(jié)構(gòu)域，1個(gè)RING結(jié)構(gòu)域，1個(gè)富含脯氨酸的區(qū)域和1個(gè)與泛素(Ub)相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，與活性血小板衍生的生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子和集落刺激因子-1受體結(jié)合并刺激其泛素化[13]。有研究表明，在P-選凝素活化β2整合素的信號(hào)通路中，存在有c-Cbl泛素化激酶介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)控過(guò)程[14]，說(shuō)明c-Cbl蛋白在炎癥反應(yīng)方面有著精細(xì)的調(diào)控作用。最近有研究表明，c-Cbl可以作為E3分子調(diào)控維甲酸誘導(dǎo)基因I(retinoic acid inducible-gene I, RIG-I)、干擾素調(diào)節(jié)因子8 (IRF8)等分子泛素化，與細(xì)胞Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生以及抗病毒反應(yīng)有密切的關(guān)系[15]。

自1992年在中國(guó)發(fā)現(xiàn)甲型H9N2流感病毒以來(lái)，已給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[16-17]。前期研究發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)的Cbl能夠抑制H9N2亞型禽流感病毒(AIV)復(fù)制[18]，說(shuō)明該蛋白具有一定的抗病毒復(fù)制功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，H9N2作為一種臨床上常見(jiàn)的AIV亞型，為多種AIV亞型提供了基因片段，具有重要的公共衛(wèi)生意義[19]?；诖耍狙芯恳匀嗽醇?xì)胞A549為宿主細(xì)胞模型，開(kāi)展Cbl蛋白表達(dá)對(duì)H9N2亞型AIV增殖的影響研究。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及細(xì)胞

人肺腺癌細(xì)胞(A549)由本實(shí)驗(yàn)室保存，采用含有10%胎牛血清1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。AIV毒株A/chicken/Shandong/LY1/2017 (H9) 由本實(shí)驗(yàn)室于2017年分離、初步鑒定并保存。Cbl siRNA(表1)和陰性對(duì)照siRNA購(gòu)自南京擎科生物科技有限公司。

表1 siRNA序列

1.2 主要試劑

GAPDH單抗，購(gòu)于Enogene生物公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，購(gòu)于優(yōu)寧維生物公司；DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、Mix、核酸膠回收試劑盒、TRIzol試劑，購(gòu)于TaKaRa公司；DMEM和胎牛血清(FBS)，購(gòu)于Gibco公司；蛋白預(yù)染Marker、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)于Invitrogen公司；抗流感病毒A核蛋白抗體 (ab20343) 和c-Cbl蛋白抗體(ab32027)，購(gòu)于Abcam公司。

1.3 Cbl基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中Cbl基因(NM_204208.1)的序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列為，F(xiàn)：5′-AAGCTTATGTCGGCTCCGCTGAAGAAGGG-3′，R：5′-GAA-TTCTTACAGGGATAACTTCGTCAGGTTACGCCTAGGC-TGAG-3′。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

在50 μL PCR體系中加入反轉(zhuǎn)錄后的HD11 cDNA模板2.5 μL，上、下游引物各1 μL，rTaq酶mix 25 μL，補(bǔ)加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，在16 ℃終止反應(yīng)。PCR結(jié)束后，回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：質(zhì)?；蚰康钠? μg、限制性內(nèi)切酶各2 μL、10 × Cutsmart buffer 5 μL、ddH2O補(bǔ)至50 μL。37 ℃酶切45 min，65 ℃ 5 min結(jié)束酶切反應(yīng)。清潔回收酶切產(chǎn)物，然后利用T4 DNA連接酶連接。16 ℃連接過(guò)夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐抗性的LB固體平板上37 ℃ 過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，選取1～3個(gè)陽(yáng)性克隆送南京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

A549細(xì)胞接種至24孔板中，待其貼壁生長(zhǎng)至密度為60%～70%，利用Lip3000轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒至A549細(xì)胞中，其中FLAG-Cbl組轉(zhuǎn)染FLAG-Cbl質(zhì)粒，F(xiàn)LAG組轉(zhuǎn)染FLAG-N空載體，對(duì)照組則僅加入Lip3000轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)液，用含2%血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。接種感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1的H9N2亞型病毒，在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞沉淀制樣，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，于5%脫脂奶中室溫封閉2 h，用PBST洗膜3次，洗膜完成后根據(jù)蛋白Marker大小剪取所需蛋白大小的膜至稀釋好的對(duì)應(yīng)單抗中，4 ℃孵育過(guò)夜。清洗后置于5%脫脂奶稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗中于37 ℃繼續(xù)孵育1 h。利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.6 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol裂解法提取細(xì)胞總RNA，并且反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 模板用于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，反轉(zhuǎn)錄體系為 20 μL：RNA 模板 6 μL；AccuRT reaction mix (4×) 2 μL；AccuRT Reaction Stopper (5×) 試劑2 μL；5× All-In-One RT MasterMix 試劑 4 μL；Nuclease-free H2O試劑6 μL；反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，最后85 ℃ 5 min。

1.7 熒光定量PCR設(shè)計(jì)合成

根據(jù) GenBank上公布的 H9N2 亞型 AIV 的血凝素(HA)、核蛋白(NP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)基因序列，設(shè)計(jì)并且合成熒光定量 PCR引物，如表2所示。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2 熒光定量PCR引物

1.8 熒光定量 PCR反應(yīng)體系和程序

反應(yīng)體系: EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10 μL，上下游引物各0.6 μL，模板DNA 2 μL，水6.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃ 1 min，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，采集信號(hào)分析結(jié)果。熒光定量PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法。

1.9 轉(zhuǎn)染siRNA

A549細(xì)胞接種至24孔板中，待其貼壁生長(zhǎng)至密度為30%～40%，利用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染相應(yīng)siRNA各50 pmol，轉(zhuǎn)染后6 h后更換培養(yǎng)液為含2%血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h。然后接種MOI=0.1的H9N2亞型AIV，分別在感染后不同時(shí)間段收集細(xì)胞樣品，采用熒光定量PCR檢測(cè)病毒HA基因相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核重組表達(dá)載體 FLAG-Cbl 構(gòu)建

以禽源HD11細(xì)胞的cDNA為模板，擴(kuò)增出Cbl片段，大小為420 bp (圖1) ，與預(yù)估大小符合。將擴(kuò)增產(chǎn)物Cbl與空載體FLAG-N連接后，以單菌落擴(kuò)增后提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR，瓊脂糖凝膠電泳顯示，在420 bp處有1條明顯條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致。PCR陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)約3 779和420 bp 2條特異條帶，如圖3所示。這些結(jié)果說(shuō)明，真核重組表達(dá)載體FLAG-Cbl已構(gòu)建成功。

M.DNA Marker;1～3.Cbl的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker;1～5.FLAG-Cbl的重組載體PCR產(chǎn)物

2.2 Cbl蛋白對(duì)H9N2病毒在A549細(xì)胞中復(fù)制的影響

2.2.1 從蛋白水平上檢測(cè)Cbl蛋白對(duì)病毒復(fù)制的影響

FLAG-Cbl 重組載體和FLAG空載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24 h，然后接種H9N2病毒，分別于6、12、24和36 h后收樣，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)病毒NP蛋白的表達(dá)情況，如圖4。結(jié)果顯示，在接毒6 h后FLAG-Cbl組的NP蛋白表達(dá)低于FLAG空載組。該結(jié)果表明表達(dá)的Cbl蛋白抑制了H9N2 病毒在A549細(xì)胞中的早期復(fù)制。

M.DNA Marker;1～3.雙酶切FLAG-Cbl重組載體

圖4 Western blot檢測(cè)病毒NP蛋白的表達(dá)

利用 Image J 軟件進(jìn)行結(jié)果分析，分析不同細(xì)胞組的NP蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH蛋白的比值，結(jié)果如圖5所示。接毒6 h時(shí)，F(xiàn)LAG-Cbl組的NP蛋白水平明顯低于對(duì)照和FLAG組(P<0.05)。接毒12 h時(shí)，F(xiàn)LAG-Cbl組的NP蛋白水平也低于對(duì)照組，不過(guò)沒(méi)有達(dá)到差異水平(P<0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2.2 從mRNA水平上檢測(cè)Cbl蛋白對(duì)病毒復(fù)制的影響

FLAG-Cbl重組載體和FLAG空載體轉(zhuǎn)染 A549 細(xì)胞24 h，分別于接種H9N2亞型病毒6、12、24和36 h收樣，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示，接毒6、12和24 h時(shí)，F(xiàn)LAG-Cbl組的病毒NP基因相對(duì)水平顯著低于對(duì)照和FLAG組(P<0.05，P<0.01)，表明重組表達(dá)的Cbl蛋白抑制了H9N2亞型AIV在A549細(xì)胞中的早期復(fù)制。在病毒接種36 h時(shí)，F(xiàn)LAG-Cbl組的病毒NP基因相對(duì)水平低于FLAG空載體組(P>0.05)，不過(guò)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

同時(shí)，采用定量PCR技術(shù)檢測(cè)了H9N2病毒的HA、NS基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在接毒6和12 h，F(xiàn)LAG-Cbl組的病毒NS基因相對(duì)水平明顯比FLAG空載體組低(P<0.05，P<0.01)(圖7)，且該組的HA基因相對(duì)水平明顯低于FLAG空載體組(P<0.05)(圖8)。在病毒接種24 h時(shí)，各試驗(yàn)組的NS和HA基因表達(dá)水平差異不大(P>0.05)。在病毒接種36 h時(shí)，F(xiàn)LAG-Cbl組的病毒NS和HA基因相對(duì)水平低于FLAG空載組，不過(guò)高于對(duì)照組。

圖7 熒光定量PCR檢測(cè)NS基因相對(duì)表達(dá)水平

2.3 敲低內(nèi)源性Cbl蛋白對(duì)H9N2病毒增殖的影響

為了探究?jī)?nèi)源性Cbl蛋白對(duì)于H9N2病毒的影響，在A549細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染對(duì)照和3條靶向Cbl蛋白的siRNA (Cbl-1、Cbl-2和Cbl-3) 敲低Cbl蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染72 h后，經(jīng)Western blot和熒光定量PCR驗(yàn)證敲低效率。與對(duì)照相比，siRNA-Cbl-1、-2和-3均敲低細(xì)胞中Cbl蛋白的蛋白表達(dá)及基因表達(dá)水平明顯減少，其中以siRNA-Cbl-1敲低Cbl蛋白和基因表達(dá)最為明顯(P<0.05)(圖9、10)。

圖8 熒光定量PCR檢測(cè)HA基因相對(duì)表達(dá)水平

圖9 Western blot檢測(cè)siRNA對(duì)Cbl蛋白的敲低作用

***表示差異極顯著(P<0.001)。下同

基于上述結(jié)果，選擇敲低效果最顯著的siRNA-Cbl-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染siRNA-Cbl-1 36 h后，以MOI=0.1的H9N2病毒感染，分別在感染后 6、12、24和36 h收集細(xì)胞樣品，做熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果如圖11所示，在A549細(xì)胞中敲低Cbl蛋白表達(dá)12～36 h時(shí)，病毒HA基因水平明顯上升(P<0.001)，說(shuō)明敲低細(xì)胞內(nèi)Cbl時(shí)，病毒復(fù)制增強(qiáng)，暗示細(xì)胞內(nèi)的Cbl蛋白能夠在一定程度上抑制H9N2病毒的復(fù)制。

圖11 熒光定量PCR檢測(cè)敲低細(xì)胞內(nèi)Cbl對(duì)病毒HA基因表達(dá)的影響

3 討論

H9N2亞型AIV已給我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并造成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全隱患[16-17]。開(kāi)展抗AIV的功能機(jī)制研究已成為眾所關(guān)注的重要課題。本研究前期發(fā)現(xiàn)，Cbl為法氏囊源活性分子的同源蛋白[9]。Cbl作為一種泛素化激酶(E3)，是細(xì)胞內(nèi)泛素化生物過(guò)程的重要組成[20-21]。有研究顯示，E3泛素連接酶可通過(guò)促進(jìn)TBK1 泛素化修飾來(lái)調(diào)控其表達(dá)及活化[22]，也可與TRAF3相互結(jié)合并對(duì)其進(jìn)行K29泛素化修飾，增強(qiáng)下游信號(hào)分子IRF3的活化，從而促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生來(lái)抑制病毒復(fù)制[23]。那么，Cbl對(duì)H9N2亞型AIV的復(fù)制影響如何，有待于進(jìn)一步探索。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了FLAG-Cbl真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，感染H9N2亞型AIV后，經(jīng)Western blot和熒光定量PCR檢測(cè)NP等病毒蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在病毒感染6和12 h時(shí)，F(xiàn)LAG-Cbl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中病毒NP、NS和HA基因表達(dá)水平均明顯低于FLAG組，且低于對(duì)照組，這說(shuō)明Cbl蛋白在H9N2亞型病毒早期復(fù)制有一定的抑制作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，病毒感染24 h時(shí)，F(xiàn)LAG-Cbl轉(zhuǎn)染組、FALG組和對(duì)照組細(xì)胞中病毒NS和HA基因表達(dá)水平相似，而在病毒感染36 h時(shí)，F(xiàn)LAG-Cbl轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中病毒NP、NS和HA基因表達(dá)水平均低于FLAG組，但高于對(duì)照組。我們推測(cè)可能是因?yàn)?4 h以后，細(xì)胞內(nèi)病毒總量復(fù)制增加，Cbl雖然具有一定抑制病毒的能力，但病毒可能通過(guò)一些機(jī)制仍在不斷增加，以至于Cbl蛋白不能充分發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的功能，這些側(cè)面說(shuō)明了Cbl蛋白僅在病毒早期發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的作用。至于其中的功能機(jī)制尚不清晰，還有待深入探索。

HA蛋白是H9N2亞型AIV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，不僅介導(dǎo)病毒吸附及穿入宿主細(xì)胞，而且是一種保護(hù)性抗原[24]。本試驗(yàn)用RNAi技術(shù)敲低細(xì)胞內(nèi)Cbl蛋白后，以HA基因水平反映H9N2亞型AIV的入侵宿主細(xì)胞及其在宿主細(xì)胞中的復(fù)制情況。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)病毒HA基因水平明顯增高。這說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)Cbl蛋白降低后，細(xì)胞內(nèi)AIV增多，暗示著細(xì)胞內(nèi)Cbl蛋白降低后，AIV復(fù)制增強(qiáng)。該結(jié)果與FLAG-Cbl轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)的結(jié)果具有一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系。這也反過(guò)來(lái)暗示了Cbl蛋白對(duì)于H9N2亞型流感病毒復(fù)制有一定的抑制作用。鄭陽(yáng)等[18]報(bào)道，重組表達(dá)的Cbl蛋白能夠在犬MDCK 細(xì)胞上抑制H9N2亞型AIV的復(fù)制。本研究以A549細(xì)胞為模型，采用不同的重組表達(dá)載體，取得了與此相似的研究結(jié)果。這暗示著Cbl能夠在不同宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抑制H9N2亞型AIV復(fù)制的功能。許多研究都證實(shí)，E3泛素連接酶家族成員可通過(guò)泛素化途徑來(lái)調(diào)控干擾素水平從而影響病毒復(fù)制情況[23]。那么，Cbl蛋白抑制AIV早期復(fù)制的作用機(jī)制是否與其泛素化調(diào)節(jié)干擾素的功能機(jī)制相關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究證實(shí)法氏囊源多肽同源蛋白Cbl的重組蛋白能夠在人源細(xì)胞模型中抑制H9N2亞型AIV的早期復(fù)制，為深入研究Cbl蛋白抗病毒復(fù)制機(jī)制提供了重要的試驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為開(kāi)展抗H9N2亞型AIV藥物提供了重要參考。