尹園英，高雁怩，夏婷婷，白娟，姜平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是引起母豬繁殖障礙和新生仔豬呼吸道疾病的重要病原，給全球生豬養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，PRRSV商品疫苗尚不理想，該病仍嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

PRRSV為單股正鏈RNA病毒，分為歐洲型、美洲型2個(gè)基因型，同一基因型毒株中又有多種基因亞型。我國(guó)主要流行的美洲型毒株包括經(jīng)典型、高致病性和NADC30樣等基因亞型毒株。該病毒基因組全長(zhǎng)約15 kb，編碼16種非結(jié)構(gòu)蛋白和8種結(jié)構(gòu)蛋白[2]。其中，GP5是病毒的主要囊膜糖基化蛋白，其序列在各毒株之間變異較大，GP5蛋白大小約25 ku，含有A和B 2個(gè)重要抗原表位。B表位高度保守，可誘發(fā)中和抗體。A表位為非中和性表位[3]。GP5蛋白是PRRSV亞單位疫苗研究的重要靶標(biāo)抗原。

為了提高PRRSV疫苗免疫保護(hù)廣譜性和GP5蛋白表達(dá)效力，本研究根據(jù)我國(guó)流行的3種基因亞型PRRSV代表性毒株的GP5基因序列，設(shè)計(jì)合成了雜合GP5基因(xGP5m)，并用PCR方法在其前端分別添加TAT、ppTG20以及MPG 3種穿膜肽[4-6]，構(gòu)建獲得4株重組桿狀病毒，獲得了可溶性表達(dá)的GP5蛋白，證明其具有的較好抗原性。

1 材料與方法

1.1 主要材料

pFastBacTMDual表達(dá)系統(tǒng)和Lipofectamine 3000為Invitrogen公司產(chǎn)品。PRRSV陽(yáng)性血清為本實(shí)驗(yàn)室制備保存。His單克隆抗體購(gòu)自翼飛雪生物科技有限公司。SPA-HRP、羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。Sf-900Ⅲ SFM無(wú)血清培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。Mini plasmid、DNA凝膠回收試劑盒、2×TaqMix均購(gòu)自南京諾唯贊公司。限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Fisher公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自購(gòu)Biouniquer公司。IPTG購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。大腸桿菌DH5α和DH10Bac菌株、Sf9細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室凍存。6～8周齡BALB/c雌鼠50只，購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物場(chǎng)。

1.2 目的基因設(shè)計(jì)與合成

選擇PRRSV代表性流行毒株S1、BB0907和FJ1402基因序列，比對(duì)分析GP5蛋白氨基酸序列，選取其共有的氨基酸組合為雜合GP5序列(xGP5)，并在C端引入6×His標(biāo)簽序列，再將其對(duì)應(yīng)基因序列按昆蟲(chóng)細(xì)胞偏嗜性優(yōu)化，命名為xGP5m。基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。根據(jù)合成基因序列，設(shè)計(jì)引物(表1)，采用PCR方法，在xGP5m基因N端分別添加3種穿膜肽(TAT、ppTG20、MPG)基因序列，實(shí)現(xiàn)融合表達(dá)(圖1)。

表1 PCR引物基因序列

A. PRRSV 3種毒株的GP5蛋白序列比對(duì)分析；B.重組蛋白示意圖及3種穿膜肽序列

1.3 重組桿狀病毒的構(gòu)建

將目的基因克隆到昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體pFastBacTMDual的PH啟動(dòng)子下的EcoRⅠ和HindⅢ 2個(gè)酶切位點(diǎn)，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pF-xGP5m、pF-TAT-xGP5m、pF-ppTG20-xGP5m和pF-MPG-xGP5m，基因測(cè)序正確。按常規(guī)方法，將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac，在X-gal、IPTG、四環(huán)素、慶大霉素和卡那霉素的平板上進(jìn)行2輪藍(lán)白斑篩選。挑取白斑進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確后提取重組Bacmids，轉(zhuǎn)染入Sf9細(xì)胞，28 ℃培養(yǎng)5 d，收獲上清即為第一代重組桿狀病毒。將獲得的重組病毒于Sf9細(xì)胞上擴(kuò)增至第3代，-80 ℃凍存。

1.4 間接免疫熒光鑒定重組桿狀病毒

將重組桿狀病毒接種長(zhǎng)滿單層的Sf9細(xì)胞，28 ℃培養(yǎng)72 h，用PBS洗滌3次后用預(yù)冷的無(wú)水乙醇于4 ℃固定30 min，洗滌3次，加入以PBS 1∶200倍稀釋的His單抗，37 ℃孵育1 h，洗滌后加入1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育30 min，洗滌后置于熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞判定為重組蛋白表達(dá)成功。

1.5 重組桿狀病毒TCID50測(cè)定

Sf9細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)準(zhǔn)備接毒用于各重組桿狀病毒TCID50的測(cè)定，方法如下：10倍比稀釋各重組桿狀病毒液，棄去96孔板中營(yíng)養(yǎng)液，每孔加入各稀釋度的病毒液100 μL，每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)重復(fù)，然后于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，方法如1.4，細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)綠色熒光則判定為陽(yáng)性孔，并使用Karber法計(jì)算各重組病毒TCID50。

1.6 Western blot檢測(cè)重組蛋白表達(dá)

將重組桿狀病毒接種Sf9細(xì)胞，28 ℃培養(yǎng)96 h，收集細(xì)胞并超聲破碎，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min分離上清沉淀，沉淀再用相同體積的PBS重懸，采用Western blot檢測(cè)，分別用His單抗(PBS 1∶5 000稀釋)、PRRSV陽(yáng)性血清(PBS 1∶200稀釋)作為一抗，二抗分別為HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體(PBS 1∶1 000稀釋)、HRP-SPA(PBS 1∶10 000稀釋)，最后用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色。

1.7 小鼠免疫試驗(yàn)

將4種重組桿狀病毒分別接種Sf9細(xì)胞(T75細(xì)胞瓶，500 μL/瓶)，接毒96 h病變明顯后棄培養(yǎng)上清，每瓶細(xì)胞加入2 mL PBS，凍融1次后，超聲破碎收獲2 mL細(xì)胞破碎液，采用Western blot半定量的方法將目的蛋白濃度調(diào)整一致，再分別與ISA206佐劑1∶1混合充分乳化制備疫苗。將6周齡BALB/c雌鼠50只隨機(jī)分為5組，每組10只，1～4組每只小鼠皮下免疫疫苗200 μL，21 d后加強(qiáng)免疫1次，第5組為空白對(duì)照組。

首免后21和42 d每組分別采血測(cè)定血清ELISA抗體效價(jià)，以P/N大于2.1的最大血清稀釋度作為血清的ELISA效價(jià)。ELISA具體步驟如下：使用碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)將純化的PRRSV全病毒抗原稀釋至2 μg/mL，100 μL/孔加入酶標(biāo)板條，37 ℃包被2 h；之后棄去孔內(nèi)液體，每孔加入200 μL PBST，振搖洗滌3次；每孔加入200 μL 5%脫脂乳，于37 ℃溫箱封閉2 h后洗滌；將分離的小鼠血清按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800依此倍比稀釋，每孔加入100 μL稀釋后的待測(cè)血清，并設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清對(duì)照，37 ℃孵育1 h后洗滌；再以PBST 1∶1 000倍稀釋HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體作為二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min后洗滌；避光加入TMB顯色液，100 μL/孔，37 ℃顯色10 min后每孔加入50 μL終止液，酶標(biāo)儀讀取OD450 nm，并計(jì)算P/N值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與鑒定

將設(shè)計(jì)合成的xGP5m基因作為模板，采用PCR方法擴(kuò)增TAT-xGP5m、ppTG20-xGP5m、MPG-xGP5m基因片段，并將4種目的基因分別克隆至pFastBacTMDual載體上的PH啟動(dòng)子下，獲得重組質(zhì)粒pF-xGP5m、pF-TAT-xGP5m、pF-ppTG20-xGP5m和pF-MPG-xGP5m，雙酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2?；驕y(cè)序結(jié)果為，xGP5m、TAT-xGP5m、ppTG20-xGP5m和MPG-xGP5m基因長(zhǎng)度分別為642、675、702和723 bp，與設(shè)計(jì)的目的基因條帶完全一致。

M. DL5000; 1.pF-xGP5酶切產(chǎn)物; 2.pFxGP5m; 3.pF-TAT-xGP5m酶切產(chǎn)物; 4.pF-TAT-xGP5m; 5.pF-ppTG20-xGP5m酶切產(chǎn)物; 6.pF-ppTG20-xGP5m; 7.pF-MPG-xGP5m酶切產(chǎn)物; 8.pF-MPG-xGP5m

2.2 重組桿狀病毒的獲得

重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化入DH10Bac，獲得含有目的基因的重組Bacmids，以pUC/M13引物對(duì)重組Bacmids進(jìn)行P鑒定。分別將鑒定為陽(yáng)性的重組Bacmids轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，于Sf9細(xì)胞傳代2次，出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變大變圓、通透性增加、脫落(圖3A)，獲得4株重組桿狀病毒rAc-xGP5m、rAc-TAT-xGP5m、rAc-ppTG20-xGP5m和rAc-MPG-xGP5m。重組病毒TCID50分別為10-8.5/0.1 mL、10-9.0/0.1 mL、10-8.5/0.1 mL和10-8.75/0.1 mL。

2.3 間接免疫熒光鑒定重組桿狀病毒

將重組桿狀病毒接種長(zhǎng)滿單層的Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)72 h，用His單抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，熒光顯微鏡下觀察，重組桿狀病毒感染細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)綠色熒光(圖3B)。

圖3 重組桿狀病毒感染Sf 9細(xì)胞引起的細(xì)胞病變(A)及間接免疫熒光試驗(yàn)(B)

2.4 Western blot檢測(cè)重組蛋白表達(dá)

將重組桿狀病毒接種長(zhǎng)滿單層的Sf9細(xì)胞，96 h后收樣分別用His-Tag單抗、PRRSV陽(yáng)性血清作為一抗進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果(圖4)顯示在上清和沉淀中均可檢測(cè)到特異性條帶，與目的蛋白大小一致，并且目的蛋白獲得了較好的糖基化修飾，表明4種重組蛋白均可以表達(dá)，且rAc-TAT-xGP5m表達(dá)量最高。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 重組桿狀病毒感染細(xì)胞裂解液離心上清液;2. 重組桿狀病毒感染細(xì)胞裂解液離心沉淀物;3. Sf9細(xì)胞裂解液

2.5 重組蛋白免疫原性分析

小鼠首次免疫后21和42 d采集小鼠血清，采用純化的PRRSV全病毒作為包被抗原，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)PRRSV抗體，結(jié)果見(jiàn)圖5。首免后42 d rAc-TAT-xGP5m免疫組抗體水平極顯著高于其他3個(gè)免疫組(P<0.001)，表明融合TAT穿膜肽可有效增強(qiáng)xGP5m免疫效果，rAc-TAT-xGP5m重組蛋白具有良好的免疫原性。

***表示P<0.001

3 討論

我國(guó)自1995年首次暴發(fā)PRRSV以來(lái)，先后出現(xiàn)高致病性PRRSV和NADC30-like毒株流行[7]。目前呈現(xiàn)多種基因亞型PRRSV流行，而且不同基因亞型毒株之間基因重組頻發(fā)，新的變異毒株不斷增多，豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失十分嚴(yán)重。

PRRSV商品化的滅活苗和弱毒苗免疫保護(hù)效果有限，安全高效的新型疫苗研制受到國(guó)內(nèi)外持續(xù)關(guān)注，包括基因疫苗、活載體疫苗和亞單位疫苗等[8-11]。Plana等[11]運(yùn)用桿狀病毒表達(dá)PRRSV的ORF2～ORF7基因，證明GP5蛋白可對(duì)免疫母豬提供部分保護(hù)。但PRRSV流行毒株GP5基因變異較大，不同毒株間交叉免疫保護(hù)作用不夠理想[12]。本研究比對(duì)了我國(guó)PRRSV主要流行毒株S1(經(jīng)典型)、BB0907(高致病型)和FJ1402(NADC30-like毒株)的GP5蛋白氨基酸序列，選取其共有的氨基酸組合為雜合GP5序列，構(gòu)建重組桿狀病毒，實(shí)現(xiàn)了GP5與3種穿膜肽的融合表達(dá)，其中TAT-xGP5m重組桿狀病毒感染細(xì)胞目的蛋白呈現(xiàn)可溶性表達(dá)，具有PRRSV抗原性和免疫原性，為PRRSV新型疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

PRRSV GP5蛋白為糖基化跨膜蛋白，基因工程表達(dá)產(chǎn)物一般與細(xì)胞膜結(jié)合，表達(dá)效率較低。穿膜肽又稱細(xì)胞穿透肽(cell-penetrating peptides，CPPs)，一般由堿性氨基酸組成，可攜帶大分子直接穿越磷脂雙分子層實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并且能通過(guò)提高免疫細(xì)胞的聚集來(lái)調(diào)控先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[13]。Keogan等[14]報(bào)道穿膜肽TAT能夠抑制HIV-1復(fù)制。肖少波等[15]研究發(fā)現(xiàn)融合表達(dá)穿膜肽VP22與PRRSV GP5能增強(qiáng)GP5蛋白誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究將3種穿膜肽(TAT、ppTG20、MPG)序列添加至xGP5m基因N端，成功構(gòu)建4種重組桿狀病毒。其中TAT-xGP5m上清和沉淀的表達(dá)量均明顯高于xGP5m、ppTG20-xGP5m和MPG-xGP5m，實(shí)現(xiàn)了GP5蛋白的高水平和可溶性表達(dá)，但是Western blot結(jié)果中存在雜帶，可能是由于His單抗及PRRSV陽(yáng)性血清與表達(dá)產(chǎn)物中的一些蛋白發(fā)生了非特異性結(jié)合。TAT-xGP5m重組桿狀病毒感染細(xì)胞的裂解物免疫小鼠，其PRRSV抗體水平明顯高于xGP5m免疫組，說(shuō)明TAT能促進(jìn)GP5蛋白可溶性表達(dá)，增強(qiáng)其小鼠體液免疫應(yīng)答能力。當(dāng)然，重組桿狀病毒感染細(xì)胞目的蛋白的表達(dá)量及其豬體免疫特性尚需進(jìn)一步研究。